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1、ELISA-2ELISA-2(乙肝兩對半的檢測)乙肝兩對半的檢測)臨床免疫學(xué)教研室臨床免疫學(xué)教研室鄧念華鄧念華【目的要求】1.掌握乙肝兩對半的檢測原理及操作過程;2.熟悉影響乙肝兩對半檢測的因素;3.進(jìn)一步熟悉酶標(biāo)儀及洗板機(jī)使用;4.了解乙肝兩對半的臨床意義?!驹怼俊酒鞑摹縎M-3型自動化酶免分析儀ZMX-988B型全自動酶標(biāo)洗板機(jī)微量加樣器吸頭等 【試劑】HBsAgELISA試劑盒HBsAbELISA試劑盒HBeAgELISA試劑盒HBeAbELISA試劑盒HbcAbELISA試劑盒【標(biāo)本】待測血清 【操作步驟】準(zhǔn)備:試劑盒各組份在37平衡30min;配洗滌液:用純化水按1:25將濃縮洗液
2、稀釋;加樣品:每孔加入待測樣品75ul/孔,同時設(shè)置陽性對照、陰性對照,空白對照(不加樣品),輕輕振蕩混勻;孵育:貼上封膜,37反應(yīng)60min;加酶結(jié)合物:每孔加入50ul/孔(空白對照不加),震蕩10秒鐘;表面抗原檢測(雙抗體夾心法)孵育:貼上封膜,37 反應(yīng)30min;洗板:洗板機(jī)5次,最后一次盡量扣干;顯色:先加顯色液A 50ul,再加入顯色液B 50ul,貼上封膜,37反應(yīng)30min(避光); (注:顯色從加入第一滴顯色液B開始計時)終止:加終止液50ul;判讀:終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。(450nm處測定吸光度)。結(jié)果判斷及解釋 COV=2.1OD陰性對照陽性:OD樣品COV 陰性
3、:OD樣品COV 檢測有效性O(shè)D陰性對照0.10, OD陽性對照1.0OD空白對照0.04(雙波長檢測)準(zhǔn)備:試劑盒各組份在37平衡30min;配洗滌液:用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋;加樣品:每孔加50ul,同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照(不加樣品);加酶結(jié)合物:每孔50ul(空白對照不加);孵育:貼上封膜,37 反應(yīng)30min;表面抗體檢測(夾心法)洗板:洗板機(jī)5次,每次洗液在孔中滯留時間10-15s,并注滿反應(yīng)微孔;顯色:先加顯色液A 50ul,再加入顯色液B 50ul,貼上封膜,37反應(yīng)15min(避光);(注:顯色從加入第一滴顯色液B開始計時)終止:加終止液50ul;判讀:終止
4、反應(yīng)后10min內(nèi)完成。(450nm處測定吸光度)結(jié)果判斷及解釋 COV=2.1 OD陰性對照( OD陰性對照低于0.05按0.05計算)陽性:OD樣品COV 陰性:OD樣品COV 檢測有效性O(shè)D陰性對照0.10,OD陽性對照1.0OD空白對照0.015(雙波長檢測)準(zhǔn)備:試劑盒各組份在37平衡30min;配洗滌液:用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋;加樣品:每孔50ul,同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照(不加樣品);加酶結(jié)合物:每孔50ul(空白對照不加);孵育:貼上封膜,37 反應(yīng)30min;e抗原檢測(夾心法)洗板:洗板機(jī)5次,每次洗液在孔中滯留時間10-15s,并注滿反應(yīng)微孔;顯色:先
5、加顯色液A50ul,再加入顯色液B50ul,貼上封膜,37反應(yīng)15min(避光);(注:顯色從加入第一滴顯色液B開始計時)終止:加終止液50ul;判讀:終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。(450nm處測定吸光度)。結(jié)果判斷及解釋 COV=2.1 OD陰性對照( OD陰性對照低于0.05按0.05計算)陽性:OD樣品COV 陰性:OD樣品COV 檢測有效性O(shè)D陰性對照0.10,OD陽性對照1.0OD空白對照0.015(雙波長檢測)e抗體檢測(競爭抑制法)準(zhǔn)備:試劑盒各組份在37平衡30min;配洗滌液:用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋;加樣品:每孔50ul,同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照(不加樣品
6、);加酶結(jié)合物:每孔50ul(空白對照不加);孵育:貼上封膜,37 反應(yīng)30min;顯色:先加顯色液A 50ul,再加入顯色液B 50ul,貼上封膜,37反應(yīng)15min(避光);(注:顯色從加入第一滴顯色液B開始計時)終止:加終止液50ul;判讀:終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。(450nm處測定吸光度)結(jié)果判斷及解釋 COV=0.5 (OD陽性對照+OD陰性對照)陽性:OD樣品COV 陰性:OD樣品COV 檢測有效性O(shè)D陰性對照1.0,OD陽性對照0.05OD空白對照0.015(雙波長檢測)c抗體檢測(競爭抑制法)準(zhǔn)備:試劑盒各組份在37平衡30min;配洗滌液:用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋
7、;加樣品:每孔加50ul(1:30稀釋樣本),同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照(不加樣品);加酶結(jié)合物:每孔50ul(空白對照不加);孵育:貼上封膜,37 反應(yīng)30min;顯色:先加顯色液A 50ul,再加入顯色液B 50ul,貼上封膜,37反應(yīng)15min(避光);(注:顯色從加入第一滴顯色液B開始計時)終止:加終止液50ul;判讀:終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。(450nm處測定吸光度)結(jié)果判斷及解釋 COV=0.5 (OD陽性對照+OD陰性對照)陽性:OD樣品COV 陰性:OD樣品COV 檢測有效性O(shè)D陰性對照1.0,OD陽性對照0.05OD空白對照0.015(雙波長檢測)1.不同品種及批號試劑組份請勿混用;2.試劑從2-8條件下取出,先在室溫平衡1h;3.最好用微量移液器加各種組份;4.每次手工加樣,應(yīng)更換吸頭;5.加樣時盡量避免反應(yīng)微孔中產(chǎn)生氣泡;6.封板膜不能重復(fù)使用;【注意事項(xiàng)】7.洗液如有結(jié)晶形成建議放置37充分
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