生物工程實(shí)驗(yàn)---雙水相萃取糖化酶

1、雙水相萃取糖化酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解雙水相萃取在生物活性物質(zhì)提取中的重要作用與意義,及其與傳統(tǒng)溶媒萃取技 術(shù)的異同。2、加深對(duì)分配系數(shù) K 、相比 R 、收率 Y 等基本概念的認(rèn)識(shí)及相圖的制作,掌握液液萃 取中基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理雙水相萃取技術(shù)是分離純化蛋白質(zhì)混合物等生物大分子的有效方法。 雙水相系統(tǒng)通常是 由水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成,相對(duì)于傳統(tǒng)溶劑萃取來(lái)說(shuō), 雙水相萃取的最大優(yōu)勢(shì)在于雙水相體系可為生物活性物質(zhì)提供一個(gè)溫和的活性環(huán)境, 因而可 在萃取過(guò)程中保持生物物質(zhì)的活性和構(gòu)象, 而且雙水相技術(shù)具有處理量大、 能耗低、 易連續(xù) 化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)。生物大

2、分子在雙水相上相和下相的濃度比被定義為分配系數(shù) (K=Cb/Ct 。 在雙水相系統(tǒng) 中有許多因素影響分配系數(shù), 包括系統(tǒng)本身的因素如系統(tǒng)組成、 聚合物分子量、 聚合物濃度、 鹽和離子強(qiáng)度、 pH 等,以及目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)如疏水作用、電荷、分子量等,通過(guò)大量實(shí)驗(yàn) 研究可以獲得特定蛋白質(zhì)和生物大分子的最適宜分離的相系統(tǒng)和最優(yōu)分配的。糖化酶亦稱淀粉 -1, 4葡萄糖苷酶。這類酶作用于淀粉分子末端,從淀粉非還原性末 端順次切開(kāi) -1, 4糖苷鍵,生成葡萄糖。它們也能作用于支鏈淀粉的 -1, 6鍵,但速度 較慢,因此分解產(chǎn)物全部為葡萄糖,作用結(jié)果使糖的還原能力迅速增高。本實(shí)驗(yàn)選用 PEG400-(NH42

3、SO4為雙水相系統(tǒng),從發(fā)酵液中萃取糖化酶。表觀分配系數(shù)bt C C K =相比bt V V R =收率RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+=1上、下相酶總量上相酶總量式中 : C b 、 C t 分別為下、上相酶濃度(活性 ;V b 、 V t 分別為下相、上相的體積。物料衡算:加入的原液總酶活 =上相酶活 ×上相體積 +下相酶活 ×下相體積三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品儀器:天平 恒溫水浴 離心機(jī) 液相混合器 刻度試管 吸管 酸式滴定管等 藥品:糖化酶 PEG400、 (NH4 2SO 4、 2%可溶性淀粉、 0.15M NaOH、 1M H2SO 4四、

4、實(shí)驗(yàn)步驟(一 、 PEG400-(NH4 2SO 4雙水相系統(tǒng)相圖的制作1. 配制 40%的硫酸銨溶液(已經(jīng)配好 。在具塞三角瓶中準(zhǔn)確稱量 7.09g 左 右的 PEG400, ,再加入 5ml 水(此時(shí)體系澄清 。2. 慢慢加入 40%(NH4 2SO 4溶液 1,不斷搖勻,直至試管開(kāi)始出現(xiàn)混濁為止, 記錄加入的 (NH4 2SO 4量;3. 再加入適量水 (水的加量按實(shí)驗(yàn)記錄部分的表依次進(jìn)行 , 使體系變澄清, 并繼續(xù)加入 40%(NH4 2SO 4,使系統(tǒng)再次變混濁;4. 如此反復(fù)操作, 計(jì)算達(dá)到混濁時(shí) PEG 和 (NH4 2SO 4在系統(tǒng)中的重量百分濃度, 得出 PEG 和 (NH4

5、 2SO 4的雙節(jié)線圖。(二雙水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定1. 用干燥的刻度試管稱取適量 PEG400,再加入適量 40% (NH4 2SO 4溶液,加 入適量水補(bǔ)足到 30ml , 在混合器上混勻, 再加入 1ml 酶液, 于混合器上混合 2 min 。 然后離心 5 min。2. 取出讀取上、下相體積及總體積,按表二中所示的稀釋倍數(shù)取樣稀釋后, 分別測(cè)其酶活。酶原液稀釋 20倍測(cè)定。3. 酶活測(cè)定方法見(jiàn)后面附錄。五、實(shí)驗(yàn)記錄表一、兩相圖制作: 注:其中帶有下劃線的部分為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要記錄的數(shù)據(jù), 其他為試驗(yàn)后需計(jì)算 整理的數(shù)據(jù)。其中第一次的 5ml 水即是最初加 PEG400后加入的 5

6、ml 水。 表二、雙水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前要準(zhǔn)確稱量空瓶的重量,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每步加水和加硫酸銨溶液步驟必須稱量總體系的重量, 另外由于 (NH4 2SO 4顯堿性,易堵塞滴定管,所以要控制好流速。 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、雙水相圖: 其中:原液總酶活 =上相酶活×上相體積 +下相酶活×下相體積 相比bt V V R =表觀分配系數(shù)bt C C K =收率 RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+=1上、下相酶總量上相酶總量經(jīng)驗(yàn)小結(jié):本次實(shí)驗(yàn)讓我們收獲了很多的同時(shí),也暴露出一些問(wèn)題,我們組在此次試驗(yàn) 中的主要不足是, 對(duì)雙水相萃取的原理步驟了解不夠, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)不知 道下一步要