第二十一章分子生物學(xué)常用技術(shù)

1、第二十一章 分子生物學(xué)常用技術(shù)與人類(lèi)基因組計(jì)劃教材精要與重點(diǎn)提示一、分子雜交與印漬技術(shù) 1分子雜交 在DNA復(fù)性時(shí)，如把不同DNA分子或DNA與RNA分子放在同一溶液中，只要這些核酸單鏈分子之間存在一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，就可在不同分子間形成雜化雙鏈，這種現(xiàn)象稱(chēng)核酸分子雜交。 2印漬技術(shù) 是將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移于固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。 3Southern blotting 將限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳后的DNA轉(zhuǎn)移至NC膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。 4Northern blotting 將電泳后的RNA轉(zhuǎn)移至NC膜上,再與核酸探針雜交的技術(shù)。 5Western blottin

2、g 將聚丙烯酰胺凝膠電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上，再與另一標(biāo)記蛋白質(zhì)分子(如抗體)雜交的技術(shù)。 6.Oot blotting 不經(jīng)電泳分離直接將樣品點(diǎn)在NC膜上用于雜交的技術(shù)。 7In situ hybridization 在組織切片或細(xì)胞涂片上直接與探針雜交的技術(shù)。 8DNA芯片技術(shù) 指采用原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。由于常用硅芯片作為支持物，且在制備過(guò)程運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，故稱(chēng)基因芯片技術(shù)。二、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù) 1概念

3、是一種快速簡(jiǎn)便的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，能在很短時(shí)間內(nèi)，將幾個(gè)拷貝的DNA放大上百萬(wàn)倍。 2工作原理 以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5'末端和3'末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留復(fù)制的機(jī)制沿模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過(guò)程，使目的DNA片段得到大量擴(kuò)增。其反應(yīng)體系包括：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+的緩沖液。3反應(yīng)步驟(1)變性 95 15s(2)退火 Tm-5 一般為55(3)延伸 72此三步為一個(gè)循環(huán)，一般進(jìn)行2530次循環(huán)。4.用途目的基因的克隆、基因的體外突變、DNA微量分析等。三

4、、核酸序列分析 1.化學(xué)裂解法(MaxamGilbert法) 2.雙脫氧末端終止法(Sanger法) 大體有四步 (1)模板引物雜交 (2)引物延長(zhǎng)與合成阻斷 (3)電泳 高壓超薄聚丙烯酰胺凝膠電泳 (4)放射自顯影直讀圖 本法用的酶是DNA聚合酶I的K1enow大片段,實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是ddNTP：dNTP的比例要適當(dāng)。四、人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)與后基因組研究1HGP主要研究?jī)?nèi)容是完成遺傳圖，物理圖，轉(zhuǎn)錄圖，序列圖，然后對(duì)資料進(jìn)行儲(chǔ)存和利用。2后基因組主要研究?jī)?nèi)容(1)功能基因組學(xué) (2)蛋白質(zhì)組學(xué) 五、疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定1功能性克隆策略指從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)克隆該致病基因的策

5、略。血友病的第因子基因是以此策略克隆成功的。 2定位克隆策略 指從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍。最后克隆該基因的策略。DMD致病基因是以此策略克隆成功的。 3候選基因克隆策略 是利用HGP的成果和基因網(wǎng)站提供的基因序列數(shù)據(jù)克隆致病基因的策略。包括非定位候選基因克隆策略和定位候選基因克隆策略。六、轉(zhuǎn)基因、核轉(zhuǎn)移與基因剔除技術(shù) 1轉(zhuǎn)基因技術(shù) 指將目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使發(fā)育成個(gè)體。該個(gè)體能把目的基因繼續(xù)傳給子代，該技術(shù)稱(chēng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。目的基因的受體動(dòng)物就是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 2核轉(zhuǎn)移技術(shù) ， 即動(dòng)物整體克隆技術(shù)。是將動(dòng)物體細(xì)胞胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去除了

6、胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體的技術(shù)。 3基因剔除技術(shù) 指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)，也叫基因靶向滅活。(測(cè)試題)一、名詞解釋 1blotting(印漬技術(shù)) 2Southern blotting 3Northern blotting 4Western blotting 5dOt blotting 6DNA芯片技術(shù) 7PCR 8功能基因組學(xué) 9蛋白質(zhì)組學(xué) 10功能性克隆11定位克隆12轉(zhuǎn)基因技術(shù)13核轉(zhuǎn)移技術(shù)14基因剔除15分子雜交二、填空題16、Southern blotting、Northern blotting和Western blotting是分別用于研究_、_和_轉(zhuǎn)移的有關(guān)技

7、術(shù)17、用PCR擴(kuò)增DNA片段，在反應(yīng)中除了用該DNA片段作為模板外，尚需加入_、_、_和_四步。18PCR的基本反應(yīng)步驟包括_、_和_三步。19Sanger法DNA測(cè)序的基本步驟包括_、_、_和_四步。20.人類(lèi)基因組計(jì)劃的主要研究?jī)?nèi)容包括_、_、_和_。21.后基因組時(shí)代的主要研究?jī)?nèi)容是_和_。22目前克隆致病相關(guān)基因的主要策略有_、_和_。23.血友病第因子的首次克隆成功所采用的克隆策略是_，而DMD(杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良)致病基因的克隆所采用的克隆策略是_。三、選擇題A型題24.經(jīng)電泳分離后將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上的技術(shù)是ASouthern blotting BNorthern

8、blottingC.Western blotting Ddot blottingEin situ hybridization25不經(jīng)電泳分離直接將樣品點(diǎn)在NC膜上的技術(shù)是ASouthern blotting BNorthern blottingCWestern blotting Ddot blottingEin situ hybridization26經(jīng)電泳分離后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上的技術(shù)是ASouthern blotting BNorthern blottingCWestern blotting Ddot blotting Ein situ hybridization 、27經(jīng)電泳后將DN

9、A轉(zhuǎn)移至NC膜上的技術(shù)是ASouthern blotting BNorthern blottingCWestern blotting DEastern blottingEin situ hybridization 28PCR的特點(diǎn)不包括A時(shí)間短，只需數(shù)小時(shí) B擴(kuò)增產(chǎn)物量大C.只需微量模板 D.用途非常廣泛 E.底物必須標(biāo)記29用于自動(dòng)化PCR儀的DNA聚合酶必須A耐熱 B耐高壓 C.耐酸 D耐堿 E. 耐低溫30PCR反應(yīng)過(guò)程中，模板DNA變性所需溫度一般是A95 B85 C75 D65 E5531PCR反應(yīng)過(guò)程中，引物粘合所需溫度一般是A72 B85 C75 D65 E5532PCR反應(yīng)過(guò)程

10、中，引物延伸所需溫度一般是A95 B82 C72 D62 E5533PCR反應(yīng)體系不包括A模板DNA BTaq DNA聚合酶 C特異性引物A、BDddNTP E含Mg2+的緩沖液34PCR的循環(huán)次數(shù)一般為A510次 B1015次20次 D2025次30次35PCR反應(yīng)體系與雙脫氧末端終止法測(cè)序體系不同的是缺少A模板 B引物聚合酶 DddNTP E緩沖液36Sanger法測(cè)序不需要AKlenow小片段 B引物 CdNTP D.標(biāo)記dNTP EddNTP37Sanger法測(cè)序的基本步驟不包括A標(biāo)記模板 B模板引物雜交C引物的延長(zhǎng)與合成阻斷 D電泳 E.放射自顯影直讀圖38Sanger法測(cè)序的四個(gè)反

11、應(yīng)體系中應(yīng)分別加入不同的A模板 B引物 C標(biāo)記dNTP DDNA聚合酶 EddNTP39人類(lèi)基因組計(jì)劃的主要研究?jī)?nèi)容不包括A遺傳圖分析 B物理圖分析 C.轉(zhuǎn)錄圖分析D序列圖分析 E蛋白質(zhì)功能分析401996年，英國(guó)科學(xué)家克隆的Dolly羊所采用的技術(shù)是A轉(zhuǎn)基因技術(shù) B核轉(zhuǎn)移技術(shù) C基因剔除技術(shù)D肽核酸技術(shù) E反義核酸技術(shù)41Maxam-Gilbert法與Sanger法測(cè)序的共同點(diǎn)是均需A引物 BKlenow大片段 CddNTPD化學(xué)裂解試劑 E電泳后放射自顯影讀圖42Sanger法測(cè)序所得直讀圖像中，由終點(diǎn)至始點(diǎn)所讀序列為A.待測(cè)DNA5 一3的堿基序列B.待測(cè)DNA3一5的堿基序列C.待測(cè)D

12、NA互補(bǔ)鏈3一5的堿基序列D.待測(cè)DNA互補(bǔ)鏈5一3的堿基序列E.引物5一3的堿基序列實(shí)驗(yàn)的特異性主要取決于聚合酶的種類(lèi) B反應(yīng)體系中模板DNA的量C.引物序列的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度 D.四種dNTP的濃度 E循環(huán)周期的次數(shù)44基因剔除(knock out)的方法主要被用來(lái)研究A基因的結(jié)構(gòu) B.基因的功能 C.基因的表達(dá) D.基因的調(diào)控 E基因的突變45反義核酸作用主要是A封閉DNA B封閉RNA C.降解DNAD降解RNA E封閉核糖體的功能46有關(guān)Sanger法測(cè)序的敘述，不正確的是A只需標(biāo)記一種dNTPB一般應(yīng)去除DNA聚合酶I的5一3外切酶活性C與dNTP相比阻斷劑應(yīng)盡可能的多D反應(yīng)時(shí)間不必太長(zhǎng)

13、E應(yīng)采用超薄高壓電泳B型題(4751)ANorthern blotting BSouthern blottingWestern blotting Ddot blotting Ein situ hybridization47限制性?xún)?nèi)切酶酶切后電泳分離再將DNA轉(zhuǎn)移至NC膜上雜交的技術(shù)是48電泳分離后將RNA轉(zhuǎn)移至NC膜上雜交的技術(shù)是49電泳分離后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上與標(biāo)記蛋白雜交的技術(shù)是50，不經(jīng)電泳直接將樣品點(diǎn)在NC膜上雜交的技術(shù)是51在組織切片上直接與探針雜交的技術(shù)是(5254)A95oC B85oC C72oC D65oC E5552PCR變性溫度一般是53PCR退火溫度一般是54PCR

14、引物延伸溫度一般是(5558)A.Taq DNA聚合酶B.末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶C.Klenow 大片段D.反轉(zhuǎn)錄酶E.Klenow 小片段55同聚物加尾連接需要56PCR需要57Sanger法測(cè)序需要58由mRNA合成cDNA需要X型題59PCR反應(yīng)體系中含有A特異性引物 BK1enow 大片段 C.dNTP DddNTP E35S-a-dATP60PCR循環(huán)的反應(yīng)步驟包括A復(fù)性 B.變性 C.退火 D引物延伸 E引物終止61DNA鏈末端合成終止法反應(yīng)體系中含有A引物 BdNTP C.ddNTP D35S-a-dATP ETaqDNA 聚合酶62DNA鏈末端合成終止法反應(yīng)體系中不含有A模板 BTa

15、q DNA聚合酶 C.ddNTP D.化學(xué)裂解試劑 E35S-a-dATP63PCR技術(shù)可以用于A.病原微生物的微量檢測(cè)B突變基因的篩選C法醫(yī)學(xué)鑒定DDNA序列分析E克隆目的基因64克隆致病相關(guān)基因的策略包括A定位克隆 B非定位候選克隆 C功能克隆D定位候選克隆 E隨機(jī)克隆65.有關(guān)人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)的描述，錯(cuò)誤的是A.最初由美國(guó)人提出B.主要任務(wù)是完成人的23對(duì)染色體堿基測(cè)序C.因真正編碼蛋白質(zhì)的序列只占15，所以HGP計(jì)劃的實(shí)際意義不大D我國(guó)未參與該計(jì)劃E該計(jì)劃至今未有進(jìn)展66HGP的主要研究?jī)?nèi)容有A繪制遺傳圖 B.繪制物理圖C. 完成轉(zhuǎn)錄圖D完成序列圖E資料的儲(chǔ)存和利用四、問(wèn)答題6

16、7何為PCR?簡(jiǎn)述其基本原理、反應(yīng)體系和主要步驟。68簡(jiǎn)述Sanger法測(cè)序的基本原理及大體過(guò)程。69如果你有翻譯活性很高的人酪氨酸酶的mRNA，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)以鑒定某個(gè)克隆的基因片段是否為酪氨酸酶的基因?(參考答案) 一、名詞解釋l，是將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移于固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。2，將限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳后的DNA轉(zhuǎn)移至NC膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。3將電泳后的RNA轉(zhuǎn)移至NC膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。4將聚丙烯酰胺凝膠電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上，再與另一標(biāo)記蛋白質(zhì)分子(如抗體)雜交的技術(shù)。5不經(jīng)電泳分離直接將樣品點(diǎn)在NC膜上用于雜交的技術(shù)。6指采用原位合成或

17、顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。由于常用硅芯片作為支持物，且在制備過(guò)程運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，故稱(chēng)基因芯片技術(shù)。7是一種快速簡(jiǎn)便的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，能在很短時(shí)間內(nèi)，將幾個(gè)拷貝的DNA放大上百萬(wàn)倍。8指探討單一細(xì)胞在其生命的一定時(shí)刻、一定條件所表達(dá)的基因的種類(lèi)和數(shù)量；比較不同細(xì)胞之間、或同一細(xì)胞在不同條件下基因表達(dá)的差異。9是指細(xì)胞或組織中基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，尤其是指對(duì)于不同生命時(shí)期，或正常、或疾病、或給藥前后的蛋白質(zhì)變化所作的分析。10，指從對(duì)

18、一種致病基因的功能的了解出發(fā)克隆該致病基因的策略。血友病的第因子基因是以此策略克隆成功的。11指從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍。最后克隆該基因的策略。DMD致病基因是以此策略克隆成功的。 12指將目的基因整合人受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)人動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。該個(gè)體能把目的墓因繼續(xù)傳給子代，該技術(shù)稱(chēng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。目的基因的受體動(dòng)物就是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 13即動(dòng)物整體克隆技術(shù)。是將動(dòng)物體細(xì)胞胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去除了胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體的技術(shù)。 14指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)，也叫基因靶向滅活。15在DNA復(fù)性時(shí)，如把不同DNA分子或DNA與RNA分子放

19、在同一溶液中，只要這些核酸單鏈分子之間存在一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，就可在不同分子間形成雜化雙鏈，這種現(xiàn)象稱(chēng)核酸分子雜交。二、填空題 16DNA RNA 蛋白質(zhì) 17引物 Taq DNA聚合酶 dNTP 含Mg2+的緩沖液18變性 退火 延伸 19模板引物雜交 引物延長(zhǎng)與合成阻斷 電泳 放射自顯影直讀圖20遺傳圖分析 物理圖分析 轉(zhuǎn)錄圖分析 序列圖分析 資料的儲(chǔ)存和利用 21功能基因組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué) 22功能性克隆 定位克隆 候選基因克隆 23功能性克隆 定位克隆三、選擇題24B 25D 26C 27A 28E 29，A 30A 31E 32C 33D 34E 35D 36A 37A 38，E

20、39E 40B 41，E 42D 43C 44B 45，B 46C 47B 48A 49C 50D 51E 52A 53E 54，C 55B 56A 57。C 58D 59A C 60B C D 61A B C D 62B D 63A B C D E 64A B C D 65C D E 66A B C D E四、問(wèn)答題67是一種快速簡(jiǎn)便的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)能在很短時(shí)間內(nèi)，將幾個(gè)拷貝的DNA放大上百萬(wàn)倍.其基本工作原理是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5末端和3末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留復(fù)制的機(jī)制沿模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過(guò)程，使目的DNA片段得到大量擴(kuò)增。其反應(yīng)體系包括：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+的緩沖液。 PCR反應(yīng)步驟為(1)變性95oC 15s (2)退火Tm一5oC一般為55oC 30s(3)延伸 72o。此三步為一個(gè)循環(huán)，一般進(jìn)行2530次循