微生物計(jì)數(shù)方法

1、微生物的顯微直接計(jì)數(shù)法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;   了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、計(jì)數(shù)原理和計(jì)數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的技能。二、實(shí)驗(yàn)原理    測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。    顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，

2、計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。    血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)（圖21-1），計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)分為16個(gè)大方格（大方格用三線隔開），而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)大方格（大方格之間用雙線分開），而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格組成。計(jì)數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為l mm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的

3、高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為1/4000mm3。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，先要測定每個(gè)小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3所以：1mm3體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4×106個(gè)小方格，即系數(shù)K=4×106 。因此：每ml菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)= 每個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)（N）×系數(shù)（K）×菌液稀釋倍數(shù)（d）三、實(shí)驗(yàn)器材 1活材料：釀酒酵母（Saccharomyces

4、cerevisiae）斜面或培養(yǎng)液。2器材：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)方法   1視待測菌懸液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋（斜面一般稀釋到10-2），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。2取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上，不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)

5、深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4靜置片刻，將血球計(jì)數(shù)板置載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。5計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央l個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6對于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)23次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否

6、則應(yīng)重新操作），求出每一個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)（N），按公式計(jì)算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。7測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：    將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中： 計(jì)數(shù)次數(shù)每個(gè)大方格菌數(shù)稀 釋倍 數(shù)試管斜面中的總菌數(shù)平均值12345 第一次                 第二次        

7、0;       稀釋平板測數(shù)法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庀♂屍桨逵?jì)數(shù)的原理，掌握涂抹平板培養(yǎng)法和混合平板培養(yǎng)法，認(rèn)識(shí)細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落特征。二、實(shí)驗(yàn)原理    稀釋平板計(jì)數(shù)是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落，即是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法，即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使成單個(gè)細(xì)胞存在（否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)

8、菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計(jì)算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計(jì)數(shù)。一般用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑等）、生物制品檢驗(yàn)、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗(yàn)。三、實(shí)驗(yàn)器材        1活材料：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。2培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（附錄三、1）3器材：90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號(hào)筆、玻璃刮鏟等。四、實(shí)驗(yàn)方法    1樣品稀釋液的制備  準(zhǔn)確稱取待測樣品l

9、0g，放入裝有90ml無菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20-30s，即成10-1稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取10-1稀釋液lml，移入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1 ml，移入裝有9ml無菌水的試管中，也吹吸三次，即成l0-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀釋菌液（圖22-1）。圖22-1  平板計(jì)數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí)，待測菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)

10、樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí)，采用10-7、10-8、10-9稀釋度，測定土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用10-4、10-5、10-6稀釋度，測定放線菌數(shù)量時(shí)，采用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測定真菌數(shù)量時(shí)，采用10-2、10-3、10-4稀釋度。2平板接種培養(yǎng)  平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。    （1）混合平板培養(yǎng)法  將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號(hào)10-9的3個(gè)平板

11、中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號(hào)10-8的3個(gè)平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中（由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換）。然后在9個(gè)平板中分別倒入已融化并冷卻至4550的細(xì)菌培養(yǎng)基(圖22-2)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。（2）涂抹平板計(jì)數(shù)法  涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個(gè)稀釋度用一個(gè)

12、滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：  將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中稀釋度10-710-810-9菌落數(shù)123平均123 平均12  3 平均                        1g樣品活菌數(shù)      計(jì)算結(jié)果時(shí)，常按下列標(biāo)準(zhǔn)從接種

13、后的3個(gè)稀釋度中選擇一個(gè)合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數(shù)。    （1）同一稀釋度各個(gè)重復(fù)的菌數(shù)相差不太懸殊。    （2）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每皿30300個(gè)菌落為宜，霉菌以每皿10100個(gè)菌落為宜。選擇好計(jì)數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計(jì)在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果按下式計(jì)算。混合平板計(jì)數(shù)法：每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)涂抹平板計(jì)效法：    每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)稀釋培養(yǎng)測數(shù)法（MPN）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^對

14、好氣性自生固氮菌的計(jì)數(shù)，了解稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)（MPN）的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理       最大或然數(shù)(most probable number，MPN)計(jì)數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，適用于測定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類群。其特點(diǎn)是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾，并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該類群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細(xì)菌等。見附表23-1）的數(shù)量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的

15、數(shù)量，缺點(diǎn)是只適于進(jìn)行特殊生理類群的測定，結(jié)果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計(jì)數(shù)時(shí)才采用。  MPN計(jì)數(shù)是將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量（如lm1）的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖。根據(jù)沒有生長的最低稀釋度與出現(xiàn)生長的最高稀釋度，采用“最大或然數(shù)”理論，可以計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。具體地說，菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，一定量菌液中細(xì)菌可以極少或無菌，然后每個(gè)稀釋度取35次重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，將有菌液生長的最后3個(gè)稀釋度（即臨界級(jí)數(shù)）中出現(xiàn)細(xì)菌生長的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)，由最大或然數(shù)表（見附錄九）上查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位

16、數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌數(shù)。如某一細(xì)菌在稀釋法中的生長情況如下；    稀釋度          lO-3    10-4    10-5    lO-6    10-7   10-8    重復(fù)數(shù)        

17、0;  5      5      5      5      5     5    出現(xiàn)生長的管數(shù)   5      5      5      4

18、      1     0    根據(jù)以上結(jié)果，在接種lO-310-5稀釋液的試管中5個(gè)重復(fù)都有生長，在接種lO-6稀釋液的試管中有4個(gè)重復(fù)生長，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個(gè)生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數(shù)量指標(biāo)為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個(gè)

19、。在確定數(shù)量指標(biāo)時(shí)，不管重復(fù)次數(shù)如何，都是3位數(shù)字，第一位數(shù)字必須是所有試管都生長微生物的某一稀釋度的培養(yǎng)試管，后兩位數(shù)字依次為以下兩個(gè)稀釋度的生長管數(shù)，如果再往下的稀釋仍有生長管數(shù)，則可將此數(shù)加到前面相鄰的第三位數(shù)上即可。如某一微生物生理群稀釋培養(yǎng)記錄為：    稀釋度           lO-1      10-2     10-3    &

20、#160;lO-4     10-5     10-6    重復(fù)數(shù)            4       4       4      4      

21、; 4       4    出現(xiàn)生長的管數(shù)    4       4       3      2       1       0    以上情況，可將最后一

22、個(gè)數(shù)字加到前一個(gè)數(shù)字上，即數(shù)量指標(biāo)為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×102個(gè)。按照重復(fù)次數(shù)的不同，最大或然數(shù)表又分為三管最大或然數(shù)表、四管最大或然數(shù)表和五管最大或然數(shù)表。    應(yīng)用MPN計(jì)數(shù)，應(yīng)注意兩點(diǎn)，一是菌液稀釋度的選擇要合適，其原則是最低稀釋度的所有重復(fù)都應(yīng)有菌生長，而最高稀釋度的所有重復(fù)無菌生長。對土壤樣品而言，分析每個(gè)生理群的微生物需57個(gè)連續(xù)稀釋液分別接種，微生物類群不同，其起始稀釋度不同(見附表1)；二是每個(gè)接種稀釋度必須有重復(fù)，重復(fù)次數(shù)可根據(jù)需要和條件而定，一般25個(gè)重復(fù)，個(gè)別也有采用2個(gè)重復(fù)的，但重復(fù)次數(shù)越

23、多，誤差就會(huì)越小，相對地說結(jié)果就會(huì)越正確。不同的重復(fù)次數(shù)應(yīng)按其相應(yīng)的最大或然數(shù)表計(jì)算結(jié)果。若要求出土樣中每克干土所含的活菌數(shù)，則要將前述兩例中所得的每毫升菌數(shù)除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（烘干后的土樣質(zhì)量原始土樣的質(zhì)量）。計(jì)算式為：         三、實(shí)驗(yàn)器材                     1. 土壤樣品：肥沃菜園

24、土2. 培養(yǎng)基：阿須貝（Ashby）無氮培養(yǎng)液(附錄三、15)22管(每管裝5ml，加1cm×4.5cm濾紙l條)3. 器材：90ml無菌水（裝入250 ml三角瓶中，并裝有1520個(gè)玻璃珠）、9ml無菌水、lml刻度無菌吸管、試管架、記號(hào)筆。四、實(shí)驗(yàn)方法    1稱取10克土樣，放入90ml無菌水中，振蕩20min，讓菌充分分散，然后按十倍稀釋法將供試土樣制成10-110-6的土壤稀釋液。2將22支裝有Ashby無氮培養(yǎng)液的試管按縱4橫5的方陣排列于試管架上，第一縱列的4支試管上標(biāo)以10-2，第二縱列的4支試管上標(biāo)以10-3第五縱列的4支管上際以10-

25、6（即采用5個(gè)稀釋度，4個(gè)重復(fù)），另外2支試管留作對照。3 用lml無菌吸管按無菌操作要求吸取10-6的土壤稀釋液各lml放入編號(hào)10-6的4支試管中，再吸取10-5稀釋液各lml放入編號(hào)10-5的4支試管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀釋液各lml放入各自對應(yīng)編號(hào)的試管中。對照管不加稀釋液。4將所有試管置2830培養(yǎng)7天后觀察結(jié)果。5精確稱取3份10克稀釋用土，放入稱量瓶中，置105-110烘2h后放入干燥器中，至恒重后稱重，然后計(jì)算干土在土樣中所占的質(zhì)量份數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：    培養(yǎng)7天后，取出試管，檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果。    凡有固氮菌生長的試管，則培養(yǎng)液與濾紙接觸處有黑褐色或粘液狀菌膜，即為陽性，否則為陰性。對照管應(yīng)為陰性。依次檢查每管生長情況，將結(jié)果填入下表，計(jì)算每克干土所含的活菌數(shù)。土壤稀釋度10-210-310-410-510-6重復(fù)次數(shù)44444固氮菌生長管數(shù)