微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件

1、微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件（NY/T 1114-2006）1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物肥料實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)基技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物肥料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)、菌種培養(yǎng)與保藏用培養(yǎng)基的制備。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 19524.1-2004   肥料中糞大腸菌群的測(cè)定NY 527-2002   

2、60;     光合細(xì)菌菌劑3術(shù)語和定義培養(yǎng)基 medium由人工配制的適合微生物生長、代謝、繁殖和保存的營養(yǎng)基質(zhì)。4培養(yǎng)基制備流程圖（略）5培養(yǎng)基選用原則5.1含有滿足所培養(yǎng)的微生物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)。5.2各種營養(yǎng)物質(zhì)要有合適的比例和濃度。5.3有合適的pH范圍和一定的緩沖pH能力。5.4有一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。5.5對(duì)于特殊用途的培養(yǎng)基，除遵循以上原則外，還應(yīng)滿足以下要求：5.5.1在選擇培養(yǎng)基中，應(yīng)加入利于目的微生物生長而抑制其它微生物生長的化學(xué)物質(zhì)。5.5.2菌種保藏培養(yǎng)基選用原則5.5.2.1對(duì)于產(chǎn)芽孢或孢子的

3、菌種保藏培養(yǎng)基應(yīng)以易產(chǎn)生芽孢或孢子為原則。5.5.2.2對(duì)于自養(yǎng)微生物的菌種保藏培養(yǎng)基應(yīng)只使用無機(jī)鹽類，不使用有機(jī)物。5.5.2.3對(duì)能利用無機(jī)氮源的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中不宜使用有機(jī)氮源。5.5.2.4對(duì)營養(yǎng)缺陷型微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中必須含有該缺陷所需的物質(zhì)。5.5.2.5對(duì)耐某種藥物的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中應(yīng)含有一定濃度的該種藥物。6要求6.1材料6.1.1用于配制培養(yǎng)基的化學(xué)試劑純度至少為化學(xué)純。6.1.2試劑出現(xiàn)顏色改變、沉淀、混濁、吸潮結(jié)塊的現(xiàn)象時(shí)，不宜使用。6.1.3天然原材料應(yīng)質(zhì)量穩(wěn)定，未發(fā)生霉變、生蟲和變質(zhì)。6.1.4瓊脂凝固后應(yīng)具有良好的透明度。6.2器皿6.2

4、.1配制試劑所用的器皿應(yīng)潔凈。6.2.2盛裝培養(yǎng)基的器皿應(yīng)由對(duì)微生物無毒害并耐高溫的材料制成。6.2.3材料需加熱溶解時(shí)，可選用玻璃容器、搪瓷缸和不銹鋼容器等，禁用銅制、鋁制和鐵制容器。6.3棉塞或硅膠塞6.3.1不應(yīng)使用脫脂棉制作棉塞。6.3.2使用棉塞或硅膠塞時(shí)，將其長度的2/3塞入容器內(nèi)。要求松緊適當(dāng)，緊貼管壁。6.3.3滅菌時(shí)，棉塞外要加包牛皮紙或耐高溫透氣塑料薄膜，以防止滅菌時(shí)棉塞受潮或進(jìn)水。6.4培養(yǎng)基配制6.4.1材料稱量6.4.1.1根據(jù)培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取相應(yīng)材料的量。6.4.1.2當(dāng)配方中某種成分微量時(shí)，可預(yù)先將該成分配制成一定濃度的母液，然后按量加入。母液須低溫保存。6.

5、4.2材料溶解6.4.2.1不溶于水的組分應(yīng)在所需的溶劑中溶解后，再加入到培養(yǎng)基中。6.4.2.2非溶性組分，如CaCO3,應(yīng)最后加入。6.4.2.3易形成沉淀的組分應(yīng)分別溶解。6.4.2.4不易溶解的組分應(yīng)做預(yù)處理。加熱溶解過程中一旦出現(xiàn)焦化現(xiàn)象時(shí)應(yīng)棄用。6.4.2.5培養(yǎng)基中含有指示劑或有顏色的試劑時(shí)，應(yīng)在培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)好之后再加入。6.4.3pH測(cè)定與調(diào)節(jié)6.4.3.1用精密pH試紙或酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的pH。6.4.3.2培養(yǎng)基的pH用稀酸或稀堿溶液調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)過程中不可用酸堿溶液反復(fù)調(diào)節(jié)。6.4.4分裝裝入三角瓶的培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過其容量的1/2，裝入試管的培養(yǎng)基體積為其容量的1/41/

6、5。分裝過程中防止培養(yǎng)基粘附在瓶口或管口。6.4.5滅菌6.4.5.1高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌控制的條件為121、維持30min。當(dāng)培養(yǎng)基中含有不耐高溫的組分時(shí)，可采用115、維持15min30min。6.4.5.2過濾除菌在無菌條件下，將待除菌溶液經(jīng)濾膜為0.2m的細(xì)菌過濾器，達(dá)到除菌的目的。適用于易受高溫破壞、失活的物質(zhì)的滅菌，如維生素。6.4.5.3干熱滅菌將待滅菌的器皿，用紙包好或放在特定的容器內(nèi)，置于烘箱中，在160左右保持2h。適用于培養(yǎng)皿等玻璃器皿的滅菌。6.4.6平板和斜面的制備在無菌條件下把冷卻至45左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，平板厚度范圍控制在3mm5mm。制備的斜面長度

7、不超過試管長度的2/5。6.5培養(yǎng)基合格檢驗(yàn)6.5.1檢查固體培養(yǎng)基濕度。培養(yǎng)基冷凝水過多或干燥出現(xiàn)裂痕時(shí)，均不能使用。6.5.2隨機(jī)抽取已滅過菌的培養(yǎng)基放入2830培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h，確定無菌生長后方可使用。6.6培養(yǎng)基存放培養(yǎng)基應(yīng)放在冰箱48保存。經(jīng)過存放的培養(yǎng)基使用前應(yīng)進(jìn)行6.5的合格檢驗(yàn)，合格后方可使用。7微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點(diǎn)和用途微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點(diǎn)和用途參見附錄A。附錄A（規(guī)范性附錄）常用培養(yǎng)基配方A.1營養(yǎng)瓊脂A.1.1成分蛋白胨          

8、;                            10.0 g牛肉膏                     &

9、#160;                3.0 g氯化鈉(NaCl)                                5.0

10、 g瓊脂                                        18.0 g蒸餾水        

11、0;                             1 000 mLpH                    

12、0;                     7.27.5A.1.2配制要點(diǎn)將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌30min。A.1.3用途適用于一般細(xì)菌培養(yǎng)和保藏。A.2芽孢桿菌培養(yǎng)基A.2.1成分蛋白胨             

13、                         5.0 g牛肉膏                        

14、60;             3.0 g土壤浸出液                                  250 mL蒸餾水 

15、                                     750mL瓊脂             

16、60;                          18. 0 gA.2.2配制要點(diǎn)土壤浸取液：土壤50g，加水200mL，121滅菌1h，過濾補(bǔ)水至250mL。其他同A.1.2A.2.3用途適用于芽孢桿菌的保藏。A.3阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基A.3.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)    

17、0;                      0.2 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                        &#

18、160; 0.2 g氯化鈉(NaCl)                                0.2 g碳酸鈣(CaCO3)             &

19、#160;                 5.0 g甘露醇(C6H14O6)                              

20、10.0 g硫酸鈣(CaSO4·2H2O)                    0.1 g瓊脂                         &#

21、160;              18.0 g蒸餾水                                  

22、0;   1 000 mLpH                                          6.87.0A.3.2配制要點(diǎn)同A.1.2A.3.3用途

23、用于固氮菌的培養(yǎng)。A.4根瘤菌培養(yǎng)基YMA.4.1成分磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                 &#

24、160;        0.2 g氯化鈉(NaCl)                                0.1 g甘露醇(C6H14O6)      

25、;                         10.0 g酵母膏                        &

26、#160;             1.0 g0.5%剛果紅溶液                              5 mL瓊脂    

27、60;                                   18.0 g蒸餾水              

28、0;                       1 000 mLpH                          

29、;                6.87.0A.4.2配制要點(diǎn)將各種營養(yǎng)成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH后，加入剛果紅溶液。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌30min。A.4.3用途適用于根瘤菌的培養(yǎng)。A.5根瘤菌培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN IIA.5.1成分酵母粉             

30、0;                        1.0 g甘露醇(C6H14O6)                       

31、0;       10.0 g土壤浸出液                                  200 mL瓊脂       &

32、#160;                                15.0 g蒸餾水                

33、60;                     800 mLpH                            

34、              7.2A.5.2配制要點(diǎn)土壤浸出液：土壤50g，加水200mL，121滅菌1h，過濾補(bǔ)水至200mL。其他同A.1.2A.5.3用途適用于根瘤菌的保藏和培養(yǎng)。A.6硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基A.6.1成分蔗糖（C12H22O11）                  

35、60;           5.0 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)                   2.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)            

36、              0.5 g碳酸鈣(CaCO3)                               0.1 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O

37、)                        0.005 g瓊脂                         &

38、#160;              18.0 g蒸餾水                                  

39、60;   1 000 mLpH                                          7.58.0A.6.2配制要點(diǎn)先將三氯化鐵配制成5的溶

40、液，按量加入，其他同A.1.2A.6.3用途適用于硅酸鹽細(xì)菌的培養(yǎng)。A.7固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基A.7.1成分乳酸鈉（C3H5O3Na）                           10.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)       

41、60;             1.67 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.87 g氯化鈉(NaCl)     

42、60;                          0.05 g氯化鈣(CaCl2)                     

43、0;         0.04 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.004 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)         &#

44、160;                0.1 g酵母膏                                 

45、;     1.0 g瓊脂                                        18.0g蒸餾水    

46、                                  1 000 mLpH               &

47、#160;                          6.87.0A.7.2配制要點(diǎn)先將三氯化鐵配制成4的溶液按量加入，其他同A.1.2。A.7.3用途適用于莖瘤根瘤菌的培養(yǎng)。A.8馬丁培養(yǎng)基A.8.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)         &

48、#160;                 1.0 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          10.0 g硫酸鎂(MgSO4·

49、7H2O)                          0.5 g蛋白胨                      

50、0;               5.0 g1%孟加拉紅水溶液                            3.3 mL氯霉素    

51、60;                                 0.1 g瓊脂                &

52、#160;                       18.0 g蒸餾水                         

53、60;            1 000 mLA.8.2配制要點(diǎn)將營養(yǎng)成分用蒸餾水溶解后，按量加入1%孟加拉紅水溶液，氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培養(yǎng)基中。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。115高壓滅菌20min。A.8.3用途適用于真菌的培養(yǎng)。A.9高氏合成一號(hào)瓊脂A.9.1成分硝酸鉀(KNO3)                &#

54、160;               1.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)      &

55、#160;                   0.5 g氯化鈉(NaCl)                            

56、0;   0.5 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        0.01 g可溶性淀粉(C6H10O5)n                

57、60;         20.0 g重鉻酸鉀（K2Cr2O7）                          0.1 g瓊脂            

58、;                            18.0 g蒸餾水                     &

59、#160;            1 000 mLpH                                   

60、60;      7.27.4A.9.2配制要點(diǎn)淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀,加熱溶解后加入。再加瓊脂，加熱溶化后分裝，121高壓滅菌30min。重鉻酸鉀配制成溶液單獨(dú)滅菌，使用時(shí)再加入到培養(yǎng)基中。A.9.3用途適用于放線菌的培養(yǎng)。A.10聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基A.10.1成分D-葡萄糖酸鈉(C6H10NaO7)                       5

61、.0 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.4 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                &#

62、160;    0.1 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g酵母膏               

63、60;                      1.0 g氯化鈉(NaCl)                          

64、      0.1 g氯化鈣(CaCl2)                               0.02 g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)       

65、0;                0.01 g鉬酸鈉（Na2MoO4）                            0.002 g瓊脂   

66、;                                     18.0 g蒸餾水            &

67、#160;                         1 000 mLpH                       &#

68、160;                  6.87.0A.10.2配制要點(diǎn)將氯化鈣配、鉬酸鈉分別配制成2的溶液，按量加入，其他同A.1.2。A.10.3用途適用于固氮螺菌的培養(yǎng)。A.11馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基A.11.1成分馬鈴薯                

69、60;                     200 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                         

70、 20.0 g瓊脂                                        18.0 g蒸餾水        

71、;                              1 000 mLA.11.2配制要點(diǎn)稱取去皮馬鈴薯200g切塊，放入水中煮沸30min，然后用雙層紗布過濾取汁，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000mL，115滅菌20min。A.11.3用途適用于酵母菌的培養(yǎng)。A.12麥芽汁瓊脂A.12.1成

72、分12波林麥芽汁（Brix）                        1 000 mL瓊脂                       

73、;                18.0 gpH                                 &#

74、160;        5.4A.12.2配制要點(diǎn)將麥芽汁調(diào)至12波林的糖度，調(diào)節(jié)pH，加入瓊脂，加熱溶化后分裝。115高壓滅菌20min。A.12.3用途適用于酵母菌的培養(yǎng)和保藏。A.13乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）A.13.1成分蛋白胨                        

75、60;             10.0 g牛肉膏                                    

76、;  10.0 g酵母膏                                      5.0 g檸檬酸氫二銨(NH4)2C6H6O7      &

77、#160;                 2.0 g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g吐溫80  

78、;                                    1.0 g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）          

79、           5.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     2.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)           

80、;               0.58 g硫酸錳(MnSO4·H2O)                           0.25 g瓊脂     

81、;                                   18.0 g蒸餾水              &

82、#160;                       1 000 mLpH                         &#

83、160;                6.26.6A.13.2配制要點(diǎn)將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121高壓滅菌20min。A.13.3用途適用于乳酸菌的培養(yǎng)。A.14光合細(xì)菌培養(yǎng)基 = 1 * ROMAN IA.14.1成分酵母粉             

84、60;                        3.0 g蛋白胨                         

85、             3.0 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g氯化鈣（CaCl2）      

86、                       0.3 g蒸餾水                          

87、60;           1 000 mLpH                                     

88、0;    6.87.0A.14.2配制要點(diǎn)同A.1.2。A.14.3用途適用于光合細(xì)菌的培養(yǎng)。 A.15光合細(xì)菌培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN IIA.15.1成分；溶液 = 1 * ROMAN I氯化鈣（CaCl2）                          

89、0;  75 mg乙酸鈉（CH3COONa）                          1.6 g煙酸                   &

90、#160;                    40 mg氯化鈉(NaCl)                           

91、0;    1.5 g生物素                                      40 mg酵母膏      

92、0;                               2.0 g硫胺素                  &

93、#160;                   40 mg氯化鎂(MgCl2)                            

94、60;  200 mg乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液               5 mL微量元素溶液                            

95、60;   1 mL蒸餾水                                      800mL溶液 = 2 * ROMAN II磷酸二氫鉀(KH2PO4)  &#

96、160;                        600 mg磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.18 g蒸

97、餾水                                      200 mL將溶液 = 1 * ROMAN I、溶液 = 2 * ROMAN II分別于121高壓滅菌15min，冷卻后將溶液&#

98、160;= 1 * ROMAN I、溶液 = 2 * ROMAN II混勻。微量元素溶液：乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8·2H2O）        2.0 g硼酸（H3BO3）                          

99、0;     100 mg氯化鋅（ZnCl2）                             100 mg高鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）          

100、;          20 mg氯化銅（CuCl2）                             10 mg硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)     

101、0;                  2.0 g氯化鈷（CoCl2·6H2O）                        100 mg氯化錳（MnCl2·4H2O） 

102、0;                      100 mg氯化鎳（NiCl2·6H2O）                        20 mg亞

103、硒酸鈉（Na2SeO3）                                             1 mg蒸餾水  

104、;                                    1 000 mL乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液:乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Na2）         

105、         20.0 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        20.0 g蒸餾水            

106、0;                         1 000 mLA.15.2配制要點(diǎn)乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液需要通氣過夜，維生素類物質(zhì)要過濾除菌后按量加入到培養(yǎng)基中。A.15.3用途適用于光合細(xì)菌的培養(yǎng)。A.16乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(用于大腸菌群初步發(fā)酵)A.16.1成分蛋白胨     

107、60;                                20.0 g    豬膽鹽             

108、;                         5.0 g    乳糖                    

109、60;                   10.0 g0.04%溴甲酚紫溶液                           25.0 mL    蒸餾水                                      1 000 mL  &