萬古霉素發(fā)酵液凝聚與絮凝研究

1、萬古霉素發(fā)酵液凝聚與絮凝研究    【摘要】  對凝聚與絮凝法預(yù)處理萬古霉素發(fā)酵液的工藝進行了研究，初步選用三種凝聚劑、三種絮凝劑，以濾速、沉淀物重量、濾液澄清度、濾液中萬古霉素含量以及萬古霉素液相色譜峰面積占總積分面積百分比為指標，考察凝聚劑與絮凝劑的作用效果。從中選擇偏鋁酸鈉、殼聚糖，并詳細研究其用量、pH對預(yù)處理效果的影響，結(jié)果顯示偏鋁酸鈉為較合適的凝聚劑。進一步討論了攪拌時間對凝聚效果的影響，通過正交試驗確定了最佳凝聚工藝條件為：pH4，偏鋁酸鈉用量750mg/L，攪拌時間6min。 【關(guān)鍵詞】  萬古霉素 偏鋁酸鈉 殼聚糖

2、凝聚 絮凝    Study on coagulation and flocculation of vancomycin fermentation broth     ABSTRACT  Coagulation and flocculation process of vancomycin fermentation broth were studied. Three coagulants and three flocculants were chosen to examine their effects on the

3、 pretreatment process. The factors including filtration rate, precipitation weight, filtrate clarifying level and vancomycin concentration in the filtrate were considered. Sodium meta?aluminate and chitosan were selected. The effects on the pretreatment by coagulant/flocculant concentration and pH v

4、alue were studied in detail. Sodium meta?aluminate was considered to be a suitable coagulant. Further experiments were carried out to study how the stirring time effected the coagulation. The optimal coagulation process condition was obtained by orthogonal design experiment and the parameters were d

5、etermined as follows: pH4; concentration of sodium meta?aluminate, 750 mg/L; stirring time: 6 min.    KEY WORDS  Vancomycin;  Sodium meta?aluminate;  Chitosan;  Coagulation;  Flocculation     萬古霉素是一種糖肽類抗生素，由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，是治療由金葡球菌引起的嚴重感染的首選藥物之一，臨

6、床上多使用其鹽酸鹽。萬古霉素發(fā)酵液預(yù)處理技術(shù)對后續(xù)分離純化工藝操作以及產(chǎn)品的收率和質(zhì)量有較大的影響，目前國內(nèi)、外針對此工藝的報道較少。 凝聚和絮凝能有效改變細胞及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，提高過濾速率，有效除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量1。凝聚與絮凝方法操作簡便易行，能耗低，所用設(shè)備及藥品成本低廉，與超濾等其它方法相比較，有獨特的優(yōu)勢，符合國內(nèi)實際情況，是工業(yè)上常用的發(fā)酵液預(yù)處理方法。    凝聚作用是指在某些電解質(zhì)作用下，使擴散雙電層的排斥電位降低，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程2。本研究使用的硫酸鋁、氯化鐵、偏鋁酸鈉(N

7、aAlO2)是常用的凝聚劑，也有報道用偏鋁酸鈉對循環(huán)冷卻水進行處理效果較好3。    絮凝作用是指在某些高分子絮凝劑作用下，懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團的過程2。本研究使用的聚丙烯酰胺、聚乙二醇、殼聚糖是常用的絮凝劑，其中殼聚糖是一種天然無毒的有機高分子絮凝劑，國內(nèi)有很多關(guān)于用殼聚糖處理發(fā)酵液的研究46。    1  材料與方法    1.1  材料與試劑    萬古霉素發(fā)酵液由本實驗室提供；硫酸鋁、氯化鐵為天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品；偏鋁

8、酸鈉天津大學(xué)化工廠(配成26%水溶液)提供；聚丙烯酰胺為天津市元立化工有限公司(配成1%水溶液)產(chǎn)品；聚乙二醇由天津市四通化工廠(配成1%水溶液)生產(chǎn)；水溶性殼聚糖由天津市光復(fù)精細化工研究所(配成0.5%水溶液)提供。所用試劑均為分析純。    1.2  主要儀器    JA21002型電子天平為上海精天電子儀器有限公司產(chǎn)品；pHS?3CW微機型酸度計為上海理達儀器廠產(chǎn)品；205型自動磁力攪拌器由美國VWR公司提供；SHB?B 95型循環(huán)水式多用真空泵由鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；DFG801型電熱鼓風箱為湖北黃石醫(yī)療器械廠

9、產(chǎn)品；SSI?PC2000型高效液相色譜儀為天津蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。    1.3  實驗方法    (1)凝聚、絮凝  取40ml發(fā)酵液置100ml燒杯中，調(diào)節(jié)pH值，加入凝聚劑或絮凝劑，攪拌，于100ml量筒中靜置2h。    (2)抽濾  吸取靜置后的上層發(fā)酵液20ml棄去，將剩余發(fā)酵液搖勻，抽濾，測濾速，以單位時間抽濾所得濾液體積計算，并觀察濾液清亮程度。    (3)沉淀物重量測定  將濾餅干燥稱重，減去干燥濾紙空重

10、，計算沉淀物重量。    (4)萬古霉素含量測定  將抽濾所得濾液稀釋五倍，用高效液相色譜法7，8測定萬古霉素含量。    2  結(jié)果與討論    2.1  凝聚劑與絮凝劑的初步篩選    (1)凝聚劑與絮凝劑的加入對原始發(fā)酵液預(yù)處理效果的影響  原始萬古霉素發(fā)酵液的pH值約為8.9，按照經(jīng)驗用量加入不同凝聚劑與絮凝劑，作用效果明顯(表1)。加入凝聚劑與絮凝劑后，濾速、沉淀物重量、萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比以及濾液澄清度

11、均有不同程度的提高；除加入聚乙二醇的試樣外，其它試樣濾液中萬古霉素含量變化不大，這可能是由于含聚乙二醇的試樣在絮凝過程中形成的一些絮凝團吸附、包含了少量的萬古霉素，使其在抽濾時留在了濾餅中。    (2)凝聚劑與絮凝劑的加入對不同pH值發(fā)酵液預(yù)處理效果的影響  為檢驗?zāi)蹌┡c絮凝劑在不同酸堿條件下的作用效果，將發(fā)酵液分為三等份，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、7.0、10.0，凝聚劑與絮凝劑用量不變，結(jié)果見表2。    由表2可知，pH值對預(yù)處理效果有一定的影響，酸性條件下的作用效果稍好。就一種凝聚劑或絮凝劑而言，pH值的變化對萬古

12、霉素含量影響并不大。    經(jīng)過上述兩個實驗的比較，初步選擇偏鋁酸鈉、殼聚糖進行后續(xù)的實驗。    2.2  偏鋁酸鈉用量對凝聚效果的影響    表3表明，偏鋁酸鈉的用量影響凝聚效果。其添加量介于500和2000mg/L時濾速較大，沉淀物重量以及萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比在750mg/L時用量時達到最大值，濾液澄清度也隨著偏鋁酸鈉用量的增加有所改善，而濾液中萬古霉素含量則稍有降低，這可能是由于過量的凝聚劑吸附了發(fā)酵液中微量的萬古霉素。綜合考慮，選擇750mg/L為較適用量。百事通

13、     2.3  pH值對偏鋁酸鈉凝聚效果的影響    發(fā)酵液pH值對凝聚效果的影響見表4。表4結(jié)果顯示，pH值的變化對絮凝效果有比較明顯的影響。酸性條件下的濾速明顯比中性及堿性條件下的濾速大，濾液澄清度較高；空白樣的沉淀物明顯較少，萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比也較低，提示加入偏鋁酸鈉能有效去除發(fā)酵液中的雜質(zhì)。空白樣還顯示，在不同pH值條件下加入一定量的凝聚劑對萬古霉素的產(chǎn)量并無較大影響。綜合考慮，選擇pH值為4。 表1        凝聚

14、劑與絮凝劑的加入對原始發(fā)酵液預(yù)處理效果的影響表3  不同偏鋁酸鈉用量對凝聚效果的影響表4  不同pH值對偏鋁酸鈉凝聚效果的影響    pH值345678910空白1空白2濾速(ml/min)9.959.618.046.456.195.335.816.292.695.95沉淀物重量(g)0.720.790.770.760.740.800.770.760.490.75濾液澄清度+-+濾液萬古霉素含量(g/L)2.492.512.512.502.502.472.482.492.492.47萬古霉素HPLC峰面積占40.8743.9643.0742.6

15、441.7444.3943.0942.6330.6842.18  總積分面積的百分比(%)    用量750mg/L，攪拌3min；  空白1：未調(diào)pH，未加偏鋁酸鈉；  空白2：未調(diào)pH，加偏鋁酸鈉。+：較澄清；  +：澄清；  -：渾濁。2.4  殼聚糖用量對絮凝效果的影響    由表5可知，體系中殼聚糖的用量影響絮凝效果。增大絮凝劑的用量有助于充分發(fā)揮架橋作用，使膠粒絮凝，但用量過多反而會引起吸附飽和，膠粒表面被殼聚糖高分子覆蓋，使體系恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)，所以隨著殼聚糖用量的

16、增加，濾液中萬古霉素含量有所下降。從濾液澄清度來看，加入殼聚糖的濾液均不如加入偏鋁酸鈉的濾液清亮，絮凝物重量也明顯低于用偏鋁酸鈉時的沉淀物重量，且萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比也普遍較低。綜合各項指標，選擇600mg/L的用量進行下一步實驗。    2.5  pH值對殼聚糖絮凝效果的影響    如表6所示，酸性條件下的絮凝效果優(yōu)于堿性條件，從空白樣可以看出，在不同pH值條件下加入適量的殼聚糖對萬古霉素含量影響不大。由于使用殼聚糖處理發(fā)酵液的整體效果仍然不如偏鋁酸鈉，故選擇偏鋁酸鈉進行進一步實驗。 

17、60;  2.6  攪拌時間對偏鋁酸鈉凝聚效果的影響    攪拌時間對凝聚效果的影響見表7。濾速、沉淀物重量以及萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比隨攪拌時間的增加先增大后減小，攪拌時間在6min時效果較好，說明如果攪拌時間太短，凝聚劑與溶液中的膠粒無法充分接觸，達不到凝聚效果，但若攪拌時間過長，則凝聚在一起的膠粒又會被打散，影響凝聚效果。    2.7  偏鋁酸鈉凝聚最佳工藝條件的確定    為選擇最佳的凝聚工藝條件，在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計了正交實驗，選用三因素三水

18、平正交實驗，以 表5 不同殼聚糖用量對絮凝效果的影響 表6 不同pH值對殼聚糖絮凝效果的影響表7  攪拌時間對偏鋁酸鈉凝聚效果的影響pH4，用量750mg/L，各個試樣濾液均較澄清。萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比為主要檢測指標。其因素水平表、實驗結(jié)果表及方差分析表見表8、表9和表10。由正交實驗結(jié)果可知，pH值對凝聚效果影響最顯著，用量次之，攪拌時間對凝聚效果影響不顯著。最表8  正交試驗因素水平表表9    正交試驗結(jié)果表10    方差分析表來源離差自由度均方離差F值顯著性A25.612 

19、 212.806  81.56  顯  著B6.885423.442721.926顯  著C3.963121.981512.62  不顯著誤差QE0.31420.157總和QT36.774  8    佳凝聚條件為A2B2C2，即pH4，偏鋁酸鈉用量750mg/L，攪拌時間6min。經(jīng)驗證，此條件下的凝聚效果較好，濾速10.51ml/min，沉淀物重量達0.90g，濾液較澄清，萬古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比達到48.82%，萬古霉素濃度為2.50g/L。    2.8  萬古霉素分離純化工藝簡述    凝聚后的發(fā)酵液經(jīng)過XAD?16大孔樹脂純化，所得洗脫液中萬古霉素液相色譜峰面積可達總積分面積的85.61%，萬古霉素濃度達到8.93g/L。洗脫液經(jīng)活性炭脫色、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、添加丙酮結(jié)晶、真空冷凍干燥等工序制得成品，純度達