萬(wàn)古霉素發(fā)酵液凝聚與絮凝研究

1、萬(wàn)古霉素發(fā)酵液凝聚與絮凝研究    【摘要】  對(duì)凝聚與絮凝法預(yù)處理萬(wàn)古霉素發(fā)酵液的工藝進(jìn)行了研究，初步選用三種凝聚劑、三種絮凝劑，以濾速、沉淀物重量、濾液澄清度、濾液中萬(wàn)古霉素含量以及萬(wàn)古霉素液相色譜峰面積占總積分面積百分比為指標(biāo)，考察凝聚劑與絮凝劑的作用效果。從中選擇偏鋁酸鈉、殼聚糖，并詳細(xì)研究其用量、pH對(duì)預(yù)處理效果的影響，結(jié)果顯示偏鋁酸鈉為較合適的凝聚劑。進(jìn)一步討論了攪拌時(shí)間對(duì)凝聚效果的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳凝聚工藝條件為：pH4，偏鋁酸鈉用量750mg/L，攪拌時(shí)間6min。 【關(guān)鍵詞】  萬(wàn)古霉素 偏鋁酸鈉 殼聚糖

2、凝聚 絮凝    Study on coagulation and flocculation of vancomycin fermentation broth     ABSTRACT  Coagulation and flocculation process of vancomycin fermentation broth were studied. Three coagulants and three flocculants were chosen to examine their effects on the

3、 pretreatment process. The factors including filtration rate, precipitation weight, filtrate clarifying level and vancomycin concentration in the filtrate were considered. Sodium meta?aluminate and chitosan were selected. The effects on the pretreatment by coagulant/flocculant concentration and pH v

4、alue were studied in detail. Sodium meta?aluminate was considered to be a suitable coagulant. Further experiments were carried out to study how the stirring time effected the coagulation. The optimal coagulation process condition was obtained by orthogonal design experiment and the parameters were d

5、etermined as follows: pH4; concentration of sodium meta?aluminate, 750 mg/L; stirring time: 6 min.    KEY WORDS  Vancomycin;  Sodium meta?aluminate;  Chitosan;  Coagulation;  Flocculation     萬(wàn)古霉素是一種糖肽類抗生素，由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，是治療由金葡球菌引起的嚴(yán)重感染的首選藥物之一，臨

6、床上多使用其鹽酸鹽。萬(wàn)古霉素發(fā)酵液預(yù)處理技術(shù)對(duì)后續(xù)分離純化工藝操作以及產(chǎn)品的收率和質(zhì)量有較大的影響，目前國(guó)內(nèi)、外針對(duì)此工藝的報(bào)道較少。 凝聚和絮凝能有效改變細(xì)胞及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，提高過(guò)濾速率，有效除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量1。凝聚與絮凝方法操作簡(jiǎn)便易行，能耗低，所用設(shè)備及藥品成本低廉，與超濾等其它方法相比較，有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，符合國(guó)內(nèi)實(shí)際情況，是工業(yè)上常用的發(fā)酵液預(yù)處理方法。    凝聚作用是指在某些電解質(zhì)作用下，使擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過(guò)程2。本研究使用的硫酸鋁、氯化鐵、偏鋁酸鈉(N

7、aAlO2)是常用的凝聚劑，也有報(bào)道用偏鋁酸鈉對(duì)循環(huán)冷卻水進(jìn)行處理效果較好3。    絮凝作用是指在某些高分子絮凝劑作用下，懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程2。本研究使用的聚丙烯酰胺、聚乙二醇、殼聚糖是常用的絮凝劑，其中殼聚糖是一種天然無(wú)毒的有機(jī)高分子絮凝劑，國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于用殼聚糖處理發(fā)酵液的研究46。    1  材料與方法    1.1  材料與試劑    萬(wàn)古霉素發(fā)酵液由本實(shí)驗(yàn)室提供；硫酸鋁、氯化鐵為天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品；偏鋁

8、酸鈉天津大學(xué)化工廠(配成26%水溶液)提供；聚丙烯酰胺為天津市元立化工有限公司(配成1%水溶液)產(chǎn)品；聚乙二醇由天津市四通化工廠(配成1%水溶液)生產(chǎn)；水溶性殼聚糖由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所(配成0.5%水溶液)提供。所用試劑均為分析純。    1.2  主要儀器    JA21002型電子天平為上海精天電子儀器有限公司產(chǎn)品；pHS?3CW微機(jī)型酸度計(jì)為上海理達(dá)儀器廠產(chǎn)品；205型自動(dòng)磁力攪拌器由美國(guó)VWR公司提供；SHB?B 95型循環(huán)水式多用真空泵由鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；DFG801型電熱鼓風(fēng)箱為湖北黃石醫(yī)療器械廠

9、產(chǎn)品；SSI?PC2000型高效液相色譜儀為天津蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。    1.3  實(shí)驗(yàn)方法    (1)凝聚、絮凝  取40ml發(fā)酵液置100ml燒杯中，調(diào)節(jié)pH值，加入凝聚劑或絮凝劑，攪拌，于100ml量筒中靜置2h。    (2)抽濾  吸取靜置后的上層發(fā)酵液20ml棄去，將剩余發(fā)酵液搖勻，抽濾，測(cè)濾速，以單位時(shí)間抽濾所得濾液體積計(jì)算，并觀察濾液清亮程度。    (3)沉淀物重量測(cè)定  將濾餅干燥稱重，減去干燥濾紙空重

10、，計(jì)算沉淀物重量。    (4)萬(wàn)古霉素含量測(cè)定  將抽濾所得濾液稀釋五倍，用高效液相色譜法7，8測(cè)定萬(wàn)古霉素含量。    2  結(jié)果與討論    2.1  凝聚劑與絮凝劑的初步篩選    (1)凝聚劑與絮凝劑的加入對(duì)原始發(fā)酵液預(yù)處理效果的影響  原始萬(wàn)古霉素發(fā)酵液的pH值約為8.9，按照經(jīng)驗(yàn)用量加入不同凝聚劑與絮凝劑，作用效果明顯(表1)。加入凝聚劑與絮凝劑后，濾速、沉淀物重量、萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比以及濾液澄清度

11、均有不同程度的提高；除加入聚乙二醇的試樣外，其它試樣濾液中萬(wàn)古霉素含量變化不大，這可能是由于含聚乙二醇的試樣在絮凝過(guò)程中形成的一些絮凝團(tuán)吸附、包含了少量的萬(wàn)古霉素，使其在抽濾時(shí)留在了濾餅中。    (2)凝聚劑與絮凝劑的加入對(duì)不同pH值發(fā)酵液預(yù)處理效果的影響  為檢驗(yàn)?zāi)蹌┡c絮凝劑在不同酸堿條件下的作用效果，將發(fā)酵液分為三等份，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、7.0、10.0，凝聚劑與絮凝劑用量不變，結(jié)果見(jiàn)表2。    由表2可知，pH值對(duì)預(yù)處理效果有一定的影響，酸性條件下的作用效果稍好。就一種凝聚劑或絮凝劑而言，pH值的變化對(duì)萬(wàn)古

12、霉素含量影響并不大。    經(jīng)過(guò)上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的比較，初步選擇偏鋁酸鈉、殼聚糖進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。    2.2  偏鋁酸鈉用量對(duì)凝聚效果的影響    表3表明，偏鋁酸鈉的用量影響凝聚效果。其添加量介于500和2000mg/L時(shí)濾速較大，沉淀物重量以及萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比在750mg/L時(shí)用量時(shí)達(dá)到最大值，濾液澄清度也隨著偏鋁酸鈉用量的增加有所改善，而濾液中萬(wàn)古霉素含量則稍有降低，這可能是由于過(guò)量的凝聚劑吸附了發(fā)酵液中微量的萬(wàn)古霉素。綜合考慮，選擇750mg/L為較適用量。百事通

13、     2.3  pH值對(duì)偏鋁酸鈉凝聚效果的影響    發(fā)酵液pH值對(duì)凝聚效果的影響見(jiàn)表4。表4結(jié)果顯示，pH值的變化對(duì)絮凝效果有比較明顯的影響。酸性條件下的濾速明顯比中性及堿性條件下的濾速大，濾液澄清度較高；空白樣的沉淀物明顯較少，萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比也較低，提示加入偏鋁酸鈉能有效去除發(fā)酵液中的雜質(zhì)?？瞻讟舆€顯示，在不同pH值條件下加入一定量的凝聚劑對(duì)萬(wàn)古霉素的產(chǎn)量并無(wú)較大影響。綜合考慮，選擇pH值為4。 表1        凝聚

14、劑與絮凝劑的加入對(duì)原始發(fā)酵液預(yù)處理效果的影響表3  不同偏鋁酸鈉用量對(duì)凝聚效果的影響表4  不同pH值對(duì)偏鋁酸鈉凝聚效果的影響    pH值345678910空白1空白2濾速(ml/min)9.959.618.046.456.195.335.816.292.695.95沉淀物重量(g)0.720.790.770.760.740.800.770.760.490.75濾液澄清度+-+濾液萬(wàn)古霉素含量(g/L)2.492.512.512.502.502.472.482.492.492.47萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占40.8743.9643.0742.6

15、441.7444.3943.0942.6330.6842.18  總積分面積的百分比(%)    用量750mg/L，攪拌3min；  空白1：未調(diào)pH，未加偏鋁酸鈉；  空白2：未調(diào)pH，加偏鋁酸鈉。+：較澄清；  +：澄清；  -：渾濁。2.4  殼聚糖用量對(duì)絮凝效果的影響    由表5可知，體系中殼聚糖的用量影響絮凝效果。增大絮凝劑的用量有助于充分發(fā)揮架橋作用，使膠粒絮凝，但用量過(guò)多反而會(huì)引起吸附飽和，膠粒表面被殼聚糖高分子覆蓋，使體系恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)，所以隨著殼聚糖用量的

16、增加，濾液中萬(wàn)古霉素含量有所下降。從濾液澄清度來(lái)看，加入殼聚糖的濾液均不如加入偏鋁酸鈉的濾液清亮，絮凝物重量也明顯低于用偏鋁酸鈉時(shí)的沉淀物重量，且萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比也普遍較低。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，選擇600mg/L的用量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。    2.5  pH值對(duì)殼聚糖絮凝效果的影響    如表6所示，酸性條件下的絮凝效果優(yōu)于堿性條件，從空白樣可以看出，在不同pH值條件下加入適量的殼聚糖對(duì)萬(wàn)古霉素含量影響不大。由于使用殼聚糖處理發(fā)酵液的整體效果仍然不如偏鋁酸鈉，故選擇偏鋁酸鈉進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。 

17、60;  2.6  攪拌時(shí)間對(duì)偏鋁酸鈉凝聚效果的影響    攪拌時(shí)間對(duì)凝聚效果的影響見(jiàn)表7。濾速、沉淀物重量以及萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比隨攪拌時(shí)間的增加先增大后減小，攪拌時(shí)間在6min時(shí)效果較好，說(shuō)明如果攪拌時(shí)間太短，凝聚劑與溶液中的膠粒無(wú)法充分接觸，達(dá)不到凝聚效果，但若攪拌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則凝聚在一起的膠粒又會(huì)被打散，影響凝聚效果。    2.7  偏鋁酸鈉凝聚最佳工藝條件的確定    為選擇最佳的凝聚工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn)，選用三因素三水

18、平正交實(shí)驗(yàn)，以 表5 不同殼聚糖用量對(duì)絮凝效果的影響 表6 不同pH值對(duì)殼聚糖絮凝效果的影響表7  攪拌時(shí)間對(duì)偏鋁酸鈉凝聚效果的影響pH4，用量750mg/L，各個(gè)試樣濾液均較澄清。萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比為主要檢測(cè)指標(biāo)。其因素水平表、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表及方差分析表見(jiàn)表8、表9和表10。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，pH值對(duì)凝聚效果影響最顯著，用量次之，攪拌時(shí)間對(duì)凝聚效果影響不顯著。最表8  正交試驗(yàn)因素水平表表9    正交試驗(yàn)結(jié)果表10    方差分析表來(lái)源離差自由度均方離差F值顯著性A25.612 

19、 212.806  81.56  顯  著B(niǎo)6.885423.442721.926顯  著C3.963121.981512.62  不顯著誤差QE0.31420.157總和QT36.774  8    佳凝聚條件為A2B2C2，即pH4，偏鋁酸鈉用量750mg/L，攪拌時(shí)間6min。經(jīng)驗(yàn)證，此條件下的凝聚效果較好，濾速10.51ml/min，沉淀物重量達(dá)0.90g，濾液較澄清，萬(wàn)古霉素HPLC峰面積占總積分面積的百分比達(dá)到48.82%，萬(wàn)古霉素濃度為2.50g/L。    2.8  萬(wàn)古霉素分離純化工藝簡(jiǎn)述    凝聚后的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)XAD?16大孔樹(shù)脂純化，所得洗脫液中萬(wàn)古霉素液相色譜峰面積可達(dá)總積分面積的85.61%，萬(wàn)古霉素濃度達(dá)到8.93g/L。洗脫液經(jīng)活性炭脫色、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、添加丙酮結(jié)晶、真空冷凍干燥等工序制得成品，純度達(dá)