川芎簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)多

1、川芎簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)多         作者：陳要臻，王嵐，馬逾英，張正銀，樊哲仁，唐琳 【摘要】 目的尋找川芎的高效分子標(biāo)記。方法以四川崇州都江堰、新都3個(gè)產(chǎn)地的川芎為材料，應(yīng)用100 條簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性（ISSR）引物、64對擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）引物對30個(gè)川芎個(gè)體進(jìn)行多態(tài)性篩               &#

2、160;       作者：陳要臻，王嵐，馬逾英，張正銀，樊哲仁，唐琳【摘要】  目的尋找川芎的高效分子標(biāo)記。方法以四川崇州都江堰、新都3個(gè)產(chǎn)地的川芎為材料，應(yīng)用100 條簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性（ISSR）引物、64對擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）引物對30個(gè)川芎個(gè)體進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果篩選到簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性特異性引物共10 條，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性特異性引物共6對；分別擴(kuò)增出106和256條條帶，多態(tài)條帶百分率分別為22.64%和 22.27%。平均標(biāo)記指數(shù)AFLP 的檢測效率(1.78)明顯高于ISSR(0.42)。

3、兩種標(biāo)記基于遺傳相似值聚類分析結(jié)果存在著一定的差異,但用Mantel測試對兩種方法檢測的遺傳一致度進(jìn)行相關(guān)性分析表明,它們之間存在著顯著的相關(guān)性( r=0.6975，p=0.014)。結(jié)論川芎具有較低的遺傳多樣性，AFLP更有效于ISSR。 【關(guān)鍵詞】  川芎 簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性川芎Ligusticum chuanxiong Hort.為傘形科藁本屬的多年生植物，是著名傳統(tǒng)中藥材。以根莖供藥用，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛的功效，用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、胸肋刺痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛等1。在中國普遍分布在四川、江西、云南、吉林、甘肅、貴州、江蘇等省。四川為川芎道

4、地產(chǎn)區(qū)2，川芎已有一千五百多年栽種的歷史。長期的自然選擇和人工選擇使不同產(chǎn)地的川芎從外部形態(tài)到有效成分的組成及含量上均存在一定差異3。但目前有關(guān)川芎的研究大多集中在藥用成分分析，藥理作用等方面3，4，遺傳多樣性研究幾乎是空白。因此，尋找高效率鑒定川芎不同種質(zhì)資源的有效分子標(biāo)記技術(shù)方法具有重要意義。    簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性 (ISSR)和 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFL P)這兩種分子標(biāo)記方法已在遺傳群體結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系分析以及基因圖譜構(gòu)建等方面得到了應(yīng)用58。ISSR與AFLP標(biāo)記均具有無需預(yù)先知道受試基因組DNA序列, DNA用量少,靈敏度高,對反應(yīng)條件不敏

5、感,重復(fù)性好,能提供豐富的關(guān)于基因組的信息等優(yōu)點(diǎn), 一般而言, AFLP具有更高的靈敏度,能檢測出更高的遺傳多樣性,但所需儀器和藥品價(jià)格昂貴,實(shí)驗(yàn)成本高,檢測過程繁瑣；ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、實(shí)驗(yàn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度不高。選擇合適的分子標(biāo)記對能否客觀反映研究對象的狀況具有重要的影響9 。本研究對ISSR和AFLP 兩種分子標(biāo)記方法進(jìn)行了比較研究, 旨在尋找適合川芎的高效分子標(biāo)記, 以期為川芎的真?zhèn)伪鎰e、遺傳育種及種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。1 材料30個(gè)川芎樣品采自四川崇州(編號(hào)110)、都江堰(編號(hào)1120)、新都(編號(hào)2130)，每樣株間隔距離至少5 m以上，每株采集

6、的葉片迅速裝入自封袋中用硅膠干燥保存，并盡快進(jìn)行總基因組DNA的提取。2 方法2.1 基因組DNA的提取采用CTAB,并進(jìn)行改良10。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，紫外分光光度儀測定DNA濃度。2.2  ISSR擴(kuò)增及檢測ISSR引物(UBC set No.9) 由加拿大哥倫比亞大學(xué)提供。從100條引物篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性較好的引物用于PCR擴(kuò)增。ISSR反應(yīng)體系為 25 l,包括2 l DNA模板( 25 ng/l ) 、0.5 l引物( 1 mmol/L)、5 l dNTP (1 mmol/L)、2 l 10 ×PCR buffer，1 U rTaq DNA聚

7、合酶和14.5 l ddH2O。dNTP，rTaq DNA聚合酶均購自TaKaRa公司;擴(kuò)增反應(yīng)在PTC100TM(Programmable Thermal Con2troller, MJ Research Inc ,美國) PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行; PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94 預(yù)變性5 min; 94 變性30 s，4852 退火45 s，72 延伸2 min,共計(jì)45個(gè)循環(huán); 72 延伸7 min; 4 10 min終止反應(yīng);擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE) ,電壓80 V,電泳時(shí)間30 min,然后用EB染色,凝膠成像系統(tǒng)照相,觀察擴(kuò)增結(jié)果。2.3 AFLP擴(kuò)增及檢

8、測接頭與引物按照文獻(xiàn)11提供的序列,由北京賽百盛公司合成。從選擇性引物中篩選出條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行AFLP分析; AFLP反應(yīng)參照文獻(xiàn)12進(jìn)行。取400 ng總DNA用EcoR (Biolabs)和Mse(Biolabs)雙酶切,酶切產(chǎn)物用T4 - 連接酶( TaKaRa)與接頭連接;然后用無選擇性堿基的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?94 變性2 min, 94 變性30 s, 56 退火30 s, 72 延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)后, 72 延伸5 min, PCR反應(yīng)結(jié)束后,置4 保存。取10 l預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物0.1×TE稀釋10倍,作為選擇性擴(kuò)增反應(yīng)模板;選擇性擴(kuò)增采

9、用“Touch down”策略。反應(yīng)程序?yàn)? 94 變性2 min, 94 變性30 s, 65 退火30 s (每個(gè)循環(huán)降低0. 7 ) , 72 延伸1 min,共12個(gè)循環(huán); 94 變性30s, 55.5退火30 s, 72 延伸1 min,在進(jìn)行23個(gè)循環(huán)后, 72 延伸5 min， PCR反應(yīng)結(jié)束后，置4 保存；5 l選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物樣品加入等體積甲酰胺染液在95 加熱5 min后立即在冰浴中冷卻。以100 bp Ladder marker作參照，用6%的變性聚丙烯酰胺膠,70 W預(yù)電泳45 min，上樣后75 W電泳70 min；銀染,照相,觀察擴(kuò)增結(jié)果。2.4 數(shù)據(jù)分析將ISSR，

10、AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物每個(gè)條帶均視為一個(gè)分子標(biāo)記(maker)，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。按凝膠同一位置上DNA帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無帶的記為“0”的格式分別輸入構(gòu)成的ISSR表型和AFLP表型數(shù)據(jù)矩陣用于進(jìn)一步的分析。應(yīng)用POPGENE1. 32軟件對30個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳參數(shù)分析,計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率( PPB, percentage of polymorphic bands) 、觀測等位基因數(shù)(Na , Observed number of alleles ) 、有效等位基因數(shù)(Ne , Effective number of alleles) 、Nei基因多樣性(H,Ne

11、is gene diversity) , Shannon信息指數(shù)( I, Shannons Information index) 、Nei遺傳距離(1978) (genetic distance)與遺傳一致度(genetic identity)等參數(shù)。并計(jì)算評(píng)價(jià)分子標(biāo)記效率參數(shù)13：有效多態(tài)率（Effective multiplex ratio，E）和標(biāo)記指數(shù)(marker index ，MI)。E = n × PPB(n為每對平均引物擴(kuò)增的條帶數(shù))；MI = E × H。用NTSYS-pc Version 2.10e 軟件進(jìn)行UPGMA(Unweighted pair g

12、roup method using arithmetic average,非加權(quán)配對算術(shù)平均法)聚類分析，得到30個(gè)樣品的聚類樹狀圖。用TFPGA軟件的Mantel檢驗(yàn)軟件檢測這兩種標(biāo)記的相關(guān)性。3 結(jié)果3.1 ISSR與AFLP的多態(tài)性效率比較利用合成的100條ISSR引物對30個(gè)川芎進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，初步篩選10條引物(見表1)。這10條ISSR引物共產(chǎn)生了106條擴(kuò)增條帶(1502 700 bp),其中24條是多態(tài)性的(見圖1)。利用合成的64對AFLP隨機(jī)引物對30個(gè)川芎進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 初步篩選6對引物(見表2)。這6對AFLP引物共產(chǎn)生了256條擴(kuò)增條帶(50500 bp), 其

13、中57條是多態(tài)性的(見圖2)。AFLP擴(kuò)增得到的多樣性參數(shù)高于ISSR擴(kuò)增得到的結(jié)果(見表3)。對于ISSR 分析,引物多態(tài)性(PPB)為22.64%，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)是0.3218,Shannon信息指數(shù)(I)是0.254 1，Neis基因多樣性(H)為0.1766，有效多態(tài)率(E)和標(biāo)記指數(shù)(MI)分別為2.40和0.42；對于AFLP分析, PPB為22.27% ,每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)是0.351 8,Shannon信息指數(shù)(I)是0.269 4，Neis基因多樣性(H)為0.189 5，有效多態(tài)率(E)和標(biāo)記指數(shù)(MI)分別為9.42和1.78。表1

14、0;  篩選出的ISSR引物序列及擴(kuò)增條帶數(shù)目（略）表2  篩選出的AFLP引物序列及擴(kuò)增條帶數(shù)目（略）3.2 同樣樣本遺傳距離與聚類結(jié)果比較根據(jù)ISSR 分析表明, Neis 遺傳距離介于0.029 50.074 4之間，所有個(gè)體的平均遺傳距離為0.0518 5，新都種群與都江堰種群之間的遺傳距離較大，崇州種群與都江堰種群之間遺傳距離較小。遺傳一致度的變化范圍為0.931 80.978 3，平均遺傳一致度為0.956 2；AFLP分析得到的30個(gè)川芎的遺傳距離在0.025 40.070 7之間，平均遺傳距離為0.050 2，其中崇州種群與都江堰種群之間遺傳距離較小，崇州與

15、新都種群之間的遺傳距離最大；遺傳一致度在0.932 00.971 1之間，平均遺傳一致度為0.955 4。兩種標(biāo)記的結(jié)果均說明，川芎在崇州、都江堰和新都種群之間的相似性較高但也存在著相當(dāng)程度的遺傳分化。但是二者揭示的結(jié)果有一定的差異。用NTSYS-pc Version 2.10e 軟件計(jì)算了基因遺傳相似度，進(jìn)而用UPGMA法聚類，結(jié)果(見圖34)表明，ISSR和AFLP標(biāo)記分別得到了基本相近但不完全相同的聚類圖。對于ISSR分析來說，崇州的10個(gè)個(gè)體(110)聚在了一起，都江堰(1120)和新都(2130)出現(xiàn)了極個(gè)別的交叉。AFLP分析來看，都江堰的聚在一起，崇州的分成了兩部分，新都的也分成了兩部分。表3  ISSR 與AFLP 分子標(biāo)記比較（略）3.3 ISSR與AFLP之間的相關(guān)性分析為了檢測ISSR與AFLP分析的相關(guān)程度,利用Mantel檢驗(yàn)對基于兩種標(biāo)記的遺傳一致度矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，兩種標(biāo)記分析的遺傳一致度的成顯著的正相關(guān)( r =0.6975,P=0.014)。4 討論4.1 多態(tài)性效率比較分析ISSR和AFLP的效率對比研究表明，川芎具有較低的遺傳多樣性以及ISSR和AFLP的多態(tài)性