復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜相互作用的研究

1、復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜相互作用的研究         10-08-23 16:04:00     編輯：studa20                     作者：何麗姍，徐斌，王光忠，劉焱文【摘要】  目的探討復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜的相互

2、作用，以了解其有效成分體內吸收的情況。方法采用平衡透析與高效液相色譜聯(lián)用技術，對復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜相互作用進行分析;同時考察了透析時間、模擬生物膜濃度和緩沖溶液pH值對復方腦得生有效成分與模擬生物膜相互作用的影響。結果復方腦得生有效成分與模擬生物膜吸收檢測結果表明，有11個指紋峰吸收明顯;模擬生物膜的濃度對復方腦得生有效成分與模擬生物膜相互作用影響較大，隨濃度增加，色譜峰面積明顯減小，符合被動吸收規(guī)律;pH值對其中3個成分的吸收有影響。結論采用脂質體平衡透析和高效液相色譜聯(lián)用的方法，能方便、有效地預測復方腦得生有效成分在體內的吸收情況，揭示該復方的潛在活性成分，為其藥效物質基

3、礎深入研究提供依據(jù)。 【關鍵詞】  復方腦得生; 脂質體模擬生物膜; 脂質體平衡透析; 高效液相色譜Abstract：ObjectiveTo explore the interaction between the effective components of Fufang Naodesheng Prescription and liposome biomembrane, in order to know the effective components of the body absorption.MethodsThe effective components of Fufang

4、Naodesheng Prescription, interacted with liposome, were analyzed and identified by the balanced dialysis and HPLC coupling technique. The experiment conditions were investigated, including the balance time, the liposome concentration, and the pH value of buffer. ResultsThe test results of interactio

5、n between the effective component of Fufang Naodesheng and liposome biomembrane indicated that there had eleven fingerprint absorption peaks. The concentration of liposome and the pH value of buffer remarkably affected the absorption of most constituents.ConclusionThe developed method can simply and

6、 effectively estimate the absorption of the effective components in Fufang Naodesheng,reveal the potential effective ingredients of this compounds, and provide the basis for further research of its material foundation.Key words： Fufang Naodesheng Prescription; Liposome biomembrane; Liposome equilibr

7、ium dialysis; HPLC腦得生片和腦得生丸為傳統(tǒng)中藥制劑，由三七、川芎、紅花、葛根、山楂5味中藥組成，收載于19952005年版中國藥典，具有活血化瘀，通經活絡的功效。本實驗室近年來對復方腦得生傳統(tǒng)制劑的藥效物質基礎進行了研究，確定了方中各中藥的有效部位，并將有效部位組方研制成腦得生軟膠囊新制劑。目前，傳統(tǒng)的中藥及復方藥效物質基礎研究尚停留在分步提取分離、確定有效部位和有效成分的體外水平，不能反映藥效物質體內吸收的情況。而藥物的生物膜通透性是藥物被吸收并進入靶點發(fā)揮藥理活性的前提，因此研究中藥復雜體系中各類成分的生物膜通透性有助于揭示其藥效物質基礎。脂質體是一種理想的模擬生物膜，國

8、內外的研究均表明，藥物與脂質體的結合和其被小腸吸收具有很好的相關性1，2。本論文主要研究復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜的相互作用，篩選出能與模擬生物膜結合的成分，以期為進一步闡釋復方腦得生的藥效物質提供科學依據(jù)。1 儀器與試藥1.1 儀器Agilent 1100 series 高效液相色譜儀(G1322A排氣閥，G1311A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器)，Agilent色譜工作站;十萬分之一天平(Sartorius BP211D);萬分之一天平(Metter Toledo AL204)。1.2 試劑透析袋(分子量12 000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司);蛋黃卵磷脂(國藥

9、集團化學試劑有限公司);三七皂苷(昌寧德康科技有限公司，20060707);川芎揮發(fā)油(本實驗室自制);山楂、紅花、葛根提取物(本實驗室自制);三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、葛根素、大豆苷元、羥基紅花黃色素A、牡荊素(均購自中國藥品生物制品檢定所);緩沖液：10 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖系統(tǒng)(pH 5.4，7.0和7.4)，乙腈(Fisher公司，色譜純)，甲醇(分析純，上海振興化工一廠)，水為自制雙蒸水，其余試劑均為分析純。所有的樣品和試劑均經0.45 m的微孔濾膜過濾。2 方法與結果2.1 色譜分析條件色譜柱為Hypersil ODS-C1

10、8(4.6 mm×250 mm，5 m);流動相為0.2%(V/V)磷酸水溶液-甲醇-乙睛，梯度洗脫: 020 min，3% 8% (甲醇)，4%6%(乙腈);2045 min， 8%8% (甲醇)，6%7%(乙腈);4560 min，8%13% (甲醇)，7%8%(乙腈);60100 min，13%12% (甲醇)，8%24%(乙腈);流速1 ml·min-1;檢測波長210nm。2.2 樣品的制備參照2005版中國藥典所收錄腦得生片的處方用量：三七78 g，川芎78 g，紅花91 g，葛根261 g，山楂(去核)157 g。根據(jù)方中各藥有效部位的收得率，稱取各中藥有效部

11、位分別為：三七皂苷5.46 g，川芎揮發(fā)油4.20 g，紅花總黃酮9.28 g，葛根總黃酮21.92 g，山楂總黃酮4.87 g。將上述各中藥有效部位組方，用20%乙醇溶解，配制成相當生藥濃度為1 g·ml-1的藥液，備用。2.3 模擬生物膜的制備稱取蛋黃卵磷脂0.30 g置10 ml容量瓶中，用乙醚溶解;將10 ml pH 7.0的磷酸鹽緩沖液加入帶磁力攪拌的燒杯中，置入浴溫為(60±1)的水浴，磁力攪拌。用注射器將溶有卵磷脂的乙醚液緩慢滴入燒杯中，攪拌至無乙醚味，用緩沖液定容到10 ml，即得濃度為30 g·L-1的脂質體溶液 (pH 7.0磷酸緩沖液制得)。

12、其它濃度和pH值的脂質體溶液制法相同3。2.4 復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜的相互作用2.4.1 平衡透析方法用透析夾將長約12 cm分子截止量為12 000的透析袋一端密封，其中加入1 ml藥液和2 ml脂質體溶液(30 g·L-1，pH 7.0)，將透析袋放入裝有緩沖液(pH 7.0)的燒杯中;另取 1個透析袋加入1 ml藥液和2 ml緩沖液(pH 7.0)做平行空白對照，其余操作相同。然后放置于4環(huán)境中透析24 h，使袋內外藥物濃度達到平衡。改用濃度為60 g·L-1，90 g·L-1的脂質體溶液及pH 值為5.4 和7.4的緩沖液同法操作，得到不同

13、濃度和不同pH條件下的透析液樣品;取透析液，揮干，用甲醇定溶至25 ml，備用。2.4.2 平衡透析時間的考察分別考察了透析時間為4，8，12，16，20和24 h的透析情況，檢測結果表明透析袋外液濃度(以大豆苷元作為檢測指標)在20 h已達最大值，在2024 h之間透析袋外液濃度不再變化，說明藥物的吸收和透析達到平衡，最后選擇透析時間為24 h4。     10-08-23 16:04:00     編輯：studa202.4.3 復方腦得生有效成分與脂質體模擬生物膜相互作用的研究復方腦得生有效成分與模擬生物膜相

14、互作用后的透析液，和復方腦得生有效成分的直接透析液的HPLC圖，如圖1所示。復方腦得生有效成分在HPLC上有22個色譜峰，與直接透析液比較，復方腦得生有效成分與生物膜結合后的透析液中有11個色譜峰的峰面積明顯減少，分別為峰4，5，8，9，10，14，15，16，17，21，22。這11個峰即是復方腦得生有效成分中能與模擬生物膜相互作用的成分，是復方腦得生中的潛在活性成分，它們部分與模擬生物膜結合后不能透過透析袋，因而峰面積減小5，6。圖1 復方腦得生有效成分直接透析液(a)和與模擬生物膜作用后透析液(b)的色譜圖2.4.4 復方腦得生有效成分指紋色譜峰的識別在復方腦得生有效成分與模擬生物膜相互

15、作用后的HPLC指紋圖譜中，通過標準品對照的方法，可以識別7個有效成分的色譜峰(如圖2所示)。在圖2中的峰4為葛根素，峰5為羥基紅花黃色素A，峰10為牡荊素，峰17為大豆苷元，峰18為三七皂苷R1， 峰20為人參皂苷Rg1，峰21為人參皂苷Re。綜合圖1和圖2可知，葛根素、羥基紅花黃色素A、牡荊素、大豆苷元、人參皂苷Re與模擬生物膜有一定的相互作用，而三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在此實驗條件下與模擬生物膜作用不大明顯。2.4.5 不同的模擬生物膜濃度對復方腦得生有效成分吸收的影響分別考察了復方腦得生有效成分與濃度為30，60和90 g·L-1 (均用pH 7.0磷酸鹽緩沖系統(tǒng)制得)的

16、模擬生物膜的作用，比較三者色譜圖的差別(如圖3所示)。圖1中峰面積有變化的11個色譜峰隨模擬生物膜濃度增加，色譜峰面積也明顯減小，在色譜圖上表現(xiàn)為a>b>c>d，表明隨著脂質體濃度的增大，復方腦得生有效成分與模擬生物膜的相互作用也增強;而圖1中峰面積沒有變化的色譜峰，在不同濃度的模擬生物膜中依然表現(xiàn)出穩(wěn)定性。a.復方腦得生與模擬生物膜作用后的透析液 b.三七皂苷R1 c.人參皂苷Rg1 d.人參皂苷Re e.大豆苷元 f.羥基紅花黃色素A g.葛根素 h.牡荊素圖2 復方腦得生有效成分與模擬生物膜作用后的透析液和標準品對照的色譜圖圖3 復方腦得生有效成分與不同濃度的模擬生物膜

17、透析色譜圖2.4.6 不同的pH值對復方腦得生有效成分吸收的影響人體內的環(huán)境是一個pH相對穩(wěn)定的緩沖體系，血液及組織液的正常pH約為7.4，細胞內液pH約為7.0，人體主要吸收器官小腸腸道內的pH約為5.4。本實驗在pH為5.4，7.0和7.4的磷酸鹽緩沖體系條件下，分別測定復方腦得生有效成分與模擬生物膜(60 g·L-1)的相互作用，比較三者的差別(如圖4所示)。結果表明，峰1，3在pH為7.4時的吸收很明顯，峰2在pH為5.4和7.0時的吸收明顯;而復方腦得生其它有效成分與模擬生物膜的作用則不隨pH值的變化而變化。圖4 復方腦得生有效成分與不同pH的模擬生物膜作用后的色譜圖3 討

18、論本實驗采用了平衡透析與高效液相色譜聯(lián)用技術研究中藥復方腦得生有效成分與模擬生物膜相互作用的新方法，將活性檢測、成分分析與成分識別相結合，適合中藥復雜體系的藥效物質基礎研究。采用0.2%(V/V)磷酸水溶液-甲醇-乙腈梯度洗脫，使復方腦得生主要有效成分得到了較好的分離，展示了較完整的HPLC色譜圖。中藥提取物復雜成分不經分離直接與模擬生物膜結合，符合中藥多成分、多靶點協(xié)同作用的特點;由于模擬生物膜可以通過改變相關的影響因子很方便地模擬人體的生理環(huán)境，且具有較好的穩(wěn)定性，從而為研究藥物在體內的吸收以及活性成分的篩選和研究提供了一種簡便的模型。【參考文獻】  1 Beigl F, Yang Q, Lundahl P. Immobilized-liposome chromatographic analysis of drug partitioning into lipid bilayersJ. J Chromatogr A, 1995, 704: 315.2 盛亮洪,李睿巖,李 萍.固定化脂質體色譜研究中藥方劑的細胞膜通透性成分及其質量控制J.分析化學, 2004, 32(12)：1595.3 平其能.現(xiàn)代藥劑學，第1版M.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1998：665.4 董倩倩,李睿巖,李 萍.丹參與脂質體模擬生物膜相互作用研究J.中國藥學雜志，2007，42(1