克隆載體與表達(dá)載體

1、克隆載體克隆載體基本性質(zhì)基本特征（或載體的構(gòu)建）原理機(jī)制常用的載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制：不相容性：可轉(zhuǎn)移性（基因工程中采用非接合性質(zhì)粒）（1）具有合適的復(fù)制起始位點(diǎn)（ORI）（2）具有合適的選擇性標(biāo)記基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才生長(zhǎng)。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。（抗菌素選擇原理）DSC101ColElPBR322pUC18PUC19TA載體噬菌體載體A噬菌體其DNA兩端的5,末端各帶有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，即cos位點(diǎn)。有

2、可替代區(qū)，即非必需區(qū)。用外源DNA片段替代這個(gè)區(qū)域，不會(huì)影響噬菌體顆粒的形成。（1）基因組大小；去除非必需區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn)（2）在DNA的非必需區(qū)插入選擇標(biāo)記：【MZ基因：基因cl失活（Cl基因：溶源過程控制基因）；Spi篩選（野生型X噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶源性E.coli中的生長(zhǎng)會(huì)受到限制的表型，稱作Spi+,即對(duì)P2噬菌體的干擾敏感）1）通過裂解過程增殖載體2）載體與外源DNA的酶切3）外源DNA與載體的連接4）重組噬菌體的體外包裝5）包裝噬菌體顆粒的感染6）篩選億噬菌體載體的克隆原理）插入式載體置換型載體（取代型載體）M13噬菌體載體M13噬菌體的基因組為單鏈

3、DNA。噬菌體顆粒的大小受其DNA端點(diǎn)制約的，不存在包裝限制。只感染雄性大腸桿菌基因間隔區(qū)（intergenicregion.IG區(qū)）基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)，內(nèi)含有復(fù)制起始位點(diǎn)，是實(shí)施改造、構(gòu)建人工載體的重點(diǎn)區(qū)域。IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè)BsuI切點(diǎn)。（2）加入酶切位點(diǎn)，在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn)。M13mpi在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZr（a-肽序列）。使克隆的DNA片段以特左單鏈的形式輸出1、以（+）鏈DNA為模板，合成互補(bǔ)（一）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型DNA（RFDNA）o2、RFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約200個(gè)拷貝。3、單鏈特異的DNA

4、結(jié)合蛋白結(jié)合在（+）鏈上，從而阻斷了苴互補(bǔ)鏈，即（一）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會(huì)不斷的合成（+）鏈DNA4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因V的蛋白質(zhì)從（+）DNA鏈上脫落卜來，M13mpnn代表系列數(shù)字對(duì)M13mpi的改進(jìn)加上常用的酶切位點(diǎn)。M13mp2:LacZ'5'端的第13個(gè)核昔受體細(xì)胞外，M13重組分子篩選簡(jiǎn)便，被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb余下的M13（+）鏈DNA則是

5、從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。（M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制）酸G突笠成A,產(chǎn)生了一個(gè)EcoRI切點(diǎn)黏粒載體考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有X-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的的特殊類蹩載體。能像入-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，弁同效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞；能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制具有較高容量的克隆能力：45kb;具有與同源性字列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力粘粒（cosmid）是帶后cos序列的質(zhì)粒。cos序列是K噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。黏粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colEl）抗性標(biāo)記（"？/產(chǎn)），cos位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣

6、轉(zhuǎn)化和增殖?？寺〉淖畲驞NA片段可達(dá)45kb。有的粘粒載體含后兩個(gè)cos位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng)4?6kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以向外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體入的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kbo重組的柯斯質(zhì)粒可象噬菌體X一樣感染大腸桿菌，弁在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。)!噬菌體能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制能像M13-DNA那樣體外包裝，弁高雙轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈D

7、NA重組操作簡(jiǎn)便，篩選容噬菌粒載體綜合了質(zhì)粒載體和M13噬菌體我體優(yōu)點(diǎn)，含有ColEl復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性選擇標(biāo)記和絲狀體噬菌體DNA間隔區(qū)（含有噬菌體DNA復(fù)制起始、終止以及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用元件）它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)泄存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，1.具有較小分子量基因組DNA,可克隆10kb的外源DNA片段，弁易于進(jìn)行分離與操作；2.編碼一個(gè)amp基因作為選擇記號(hào)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；3.拷貝數(shù)含呈：高4.存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此多種不同類型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入

8、到載體分子上；5.多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌lacZ基因的5'-端編用區(qū)，可按照IPTG顯色反應(yīng)試驗(yàn)篩選6.lacZ基因是程于lac啟動(dòng)子的控制之下，插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；7含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，可復(fù)制形成大量的雙鏈DNApUC118和pUC119噬菌體一質(zhì)粒雜合載體易可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體分子&帶有一個(gè)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，弁包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中：9.;在pUC118和PUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苜酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈D

9、NA,另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA人工染色體染色體具有復(fù)制功能，利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體稱為人工染色體裁體其裝載外源DNA的容量比質(zhì)粒、噬菌體和噬菌體-質(zhì)粒雜合載體等有很大的拓展，甚至可以跟染色體的大小相媲美。人工染色體載體拷貝數(shù)少，制備困難，通常采取“穿梭載體”的策略來解決含有質(zhì)粒載體所必備的第一受體（大腸桿菌）質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，這樣的載體在大腸桿菌內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制，含有第二受體（如酯母）端粒（TEL）、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)（ARS）和著絲粒（CEN）以及合適的選擇標(biāo)記。載體在體外與目的DNA重組后轉(zhuǎn)化到第二受體細(xì)胞，按照染色體復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞

10、。篩選第受體的克隆Q股采用抗生素抗性選擇標(biāo)記；篩選第一受體的克隆子常用與受體互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。酪母人工染色體載體YAC細(xì)菌人工染色體裁體BACP1噬菌體人工染色體載體PAC質(zhì)粒載體總結(jié)質(zhì)粒載體長(zhǎng)度選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)pSClOl天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)緊型、低拷貝型9.09kb四環(huán)素抗性Tetr7個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoRLXhokPvuLHindIILBamHRSalI、SamI主要使用EcoRIColEl天然質(zhì)粒，屬松弛型多拷貝型6.3kb大腸桿菌素（colicin）El和對(duì)El免疫的基因（immEl）EcoRI位于日內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致El失活，使受體菌不能合成日（ColEl）,但仍然表現(xiàn)出對(duì)El免疫

11、型（ImmEl+）pBR322兀件來源復(fù)制起點(diǎn)oripMB1系列（來源于ColEl）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)Amp基因pSP2124質(zhì)粒的Amp基因Tetr基因pSClOl的Tct基因a4363bp氨下青年系和四環(huán)素抗性24個(gè)克隆位點(diǎn)。其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致TcU基因失活（如BamHI>HindUKSall）：3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Amp基因失活（SeaLPvul、PstI）opuc系列來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（ii）氨節(jié)青篷素抗性基因（ampr）,但它/、再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)；（iii）大腸桿菌卜半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼*肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為如Z基因

12、；（iv）位于lacZ,基因中的靠近5=端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，但它弁不破壞該基因的功能2.7kbAmpicillin抗性和lacZ的a肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lac乙基因的5'端。TA載體耐熱聚合酶可在PCR廣物的丁端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺瞟吟核昔（A）o根據(jù)這一特點(diǎn)研制出線性TA質(zhì)粒載體，其5,端各帶有一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺喀嚨（T）,用該載體可進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接克隆。TA載體構(gòu)建：在一般質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建。方法1:先采用限制性內(nèi)切核酸酶酶切使質(zhì)粒載體線性化，再通過Klcnow片段將酶切的線性載體末端補(bǔ)平方法2:利用產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)

13、切核酸酶酶切產(chǎn)生平末端，最后將線性化鈍末端質(zhì)粒載體加T反應(yīng)形成。目前有很多公司推出了TA質(zhì)粒載體。X噬菌體載體入噬菌體載體分類插入式載體一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體入噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。cl基因插入失活：如入gtlO.XNM1149等載體，在cl基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cl基因的失活。cl基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有Ec

14、oRI位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白篩選）置換型載體（取代型載體）具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的XDNA區(qū)段可以被外源DNA片段所取代野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段這些載體是用Lac5替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac5作為選擇標(biāo)記使用時(shí)用EcoRl水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染Ee"?使之在E.coli內(nèi)繁殖，弁裂解E.coli,形成空斑。置換型X噬菌體是使用最廣泛的載體。人工染類別元件優(yōu)點(diǎn)酪母人工染色體載體YAC是最常用來克隆很大DNA片段（2Mb）的系統(tǒng)。為構(gòu)建YA

15、C需要結(jié)合四個(gè)短序列：即二個(gè)端粒、一個(gè)著絲粒和一個(gè)ARS元件，弁將一適當(dāng)大小的外源DNA連接成一線性DNA分子，而端粒序列位于正確的末端。YAC的構(gòu)建有比在名田菌中克隆的一些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟承┱婧思?xì)胞的序列，特別是重復(fù)序列是難以甚至不可能在細(xì)菌中繁殖的，酪母細(xì)胞卻具有這樣的能力色體細(xì)菌人工染色體載體BAC是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的，高通疑低拷貝的質(zhì)?；蝮w每個(gè)環(huán)狀DNA分子中攜個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子oriS（Shizuyaetal.1992）,一個(gè)易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RcpE）以及二個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（p

16、arA,purB,和parC）以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化率高，構(gòu)建BAC文庫比YAC文庫更容易：BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，從大腸桿菌中提取質(zhì)粒較方便，而從酯母中分離DNA較困難：BAC的復(fù)制子來源于F因子，可穩(wěn)泄遺傳，嵌合及重組現(xiàn)象少；可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因，方便快捷；BAC載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有T7和Sp6聚合酶啟動(dòng)子，可以用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序。表達(dá)載體分類結(jié)構(gòu)組成及表達(dá)兀件特點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)備注質(zhì)粒表達(dá)載體原核表達(dá)載體1啟動(dòng)子、2轉(zhuǎn)錄終止子（防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性）3核糖體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)方式有：組成型表達(dá)，誘導(dǎo)型表達(dá)。融合型表達(dá)，分泌型表

17、達(dá)。啟動(dòng)子類型:根據(jù)作用方式及功能分類組成型啟動(dòng)子組織特異啟動(dòng)子又稱器官特異性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子酪母表達(dá)載體來自pBR322基本計(jì)架含有該質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）,lacZ基因、bla或amp>tef等基因。含有URA3、HIS3、LEU2、TRPXLYS2與特立的宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體互補(bǔ)篩選或利用zeocin>basticidin（殺稻溫菌素）的抗性基因篩選。啟動(dòng)子有GAP、A0X1、AUG1和GALI等。GAP是組成型啟動(dòng)子。英余是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。酪母表達(dá)載體多為穿梭載體：既可以在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA進(jìn)行體外操作，又可以在酯母中復(fù)制、表達(dá)和選擇。融合蛋白表達(dá)載體

18、：于外源基因插入位點(diǎn)的C端或N端插入了1個(gè)6XHis標(biāo)簽,或在丁端插入了a-因由于原核生物和真核生物存在糖基化、?；确g后修飾反應(yīng)機(jī)制的差異，K?核基因的原核表達(dá)難以獲得有活性的蛋白。酯母成為K?核表達(dá)的首選系統(tǒng)。子作為分泌信號(hào)Ti一元質(zhì)粒載體去J載體一元載體就是含目的基因的中間表達(dá)載體與改造后的受體(Ti質(zhì)粒)通過同源重組所 產(chǎn)生 的一種復(fù)合型載體，也稱為共整合載體。由于 該載體的T-DNA區(qū)與Vir區(qū)緊密 連鎖，也稱 為順式載體(cis-vector)二元載體雙元表達(dá)載體系統(tǒng)主要包括兩個(gè)部分： 一部 分為卸甲Ti質(zhì)粒，這類Ti質(zhì)粒由于缺 失了 T-DNA區(qū)域，完全喪失了致瘤作用，主要是

19、提供Vir基因功能，激活處于反式位 置上的T- DNA的轉(zhuǎn)移。另一部份是微型Ti質(zhì)粒，它在T-DNA左右邊界序列之間提供植株選擇標(biāo)記 如NPTII基因以及Lac ZTi質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的可引發(fā)植物產(chǎn)生冠櫻瘤的質(zhì)粒。根據(jù)冠痿瘤合成的 冠痿 堿種類，Ti質(zhì)?？煞譃檎卖~堿、農(nóng)桿堿、農(nóng) 桿菌素和琥珀堿4種不同類型Ti質(zhì)?？煞?為 T-DNA、Vir、Con 和 Ori 4 個(gè)功能區(qū)。T- DNA區(qū)是Ti質(zhì)粒中能轉(zhuǎn) 移到植物細(xì)胞內(nèi)的 區(qū)域。Vir區(qū)位于T-DNA區(qū)的上游，其表達(dá) 產(chǎn)物可激活 T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這 一個(gè)區(qū)域也稱為致病區(qū)。Con區(qū)該區(qū)含有與農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn) 移有關(guān) 的基因(&

20、quot;“)，這些基因受宿主細(xì)胞合成的冠櫻堿激活，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌之 間轉(zhuǎn)移。 Ori區(qū) 調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，為復(fù)制 起 始區(qū)構(gòu)建的基本原理：引入分子質(zhì)量較小的中間載體，將欲轉(zhuǎn)化的目 的基因及抗性標(biāo)記基因構(gòu)建到中間載體上。將Ti質(zhì)粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，僅 保留 其兩邊界及與T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的25個(gè)堿基序 列，構(gòu)建成所謂卸甲載體。在卸甲載體的T-DNA區(qū)被刪除致瘤基因位點(diǎn)插入中間載體同源的質(zhì)粒序列，將中間載體轉(zhuǎn)入含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中，構(gòu)建在中間載體上目的基因可通過同源重組整合到卸甲載體 Ti質(zhì) 粒的T-DNA 區(qū)，弁與卸甲載體Ti質(zhì)粒一起復(fù) 制。雙元載體系統(tǒng)的 構(gòu)建的

21、原理是Ti質(zhì)粒上的Vir 基因可以反式激活 T-DNA的轉(zhuǎn)移。與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個(gè) 質(zhì) 粒之間的同源序列，不需要共整合過程就能 在農(nóng) 桿菌內(nèi)獨(dú)立復(fù)制雙元表達(dá)載體構(gòu)件方便，轉(zhuǎn)化效率高于一元 載體。病毒表達(dá)載體桿狀病母表達(dá)我體桿狀病母表達(dá)系統(tǒng)的基本兀件：(1)啟動(dòng)子：多個(gè)啟動(dòng)子同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因。(2)polyA加尾信號(hào)：(3)向源重組序歹1。(4)穿梭載體必需元件。除帶有病毒自身的復(fù)制起始位點(diǎn)外，還帶啟pUC質(zhì)粒的復(fù)制子及以am/f,可以在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。篩選標(biāo)記。重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：接近天然蛋白。能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：研究糖基化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能影響方而的理想模型

22、。表達(dá)水平高：最高可使目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50%。能容納大分子的插入片段：上限未知。能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因：在同一細(xì)胞內(nèi)同桿狀病母科病母，桿狀病母顆粒，雙鏈閉合環(huán)狀DNA病毒，專一性感染無脊椎動(dòng)物將外源基因先克隆到轉(zhuǎn)移載體上，再與病毒基因組共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)的同源重組獲得帶有外源基因的重組病毒的策略。時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。能表達(dá)基因組DNA:昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有剪切的功能。對(duì)重組蛋白進(jìn)行定位的功能：如將核蛋白轉(zhuǎn)送到細(xì)胞核上，膜蛋白則左位在膜上，分泌蛋白則可分泌到細(xì)胞外等。腺病毒載體反泡沫轉(zhuǎn)錄類病慢病毒毒類載體致癌4主 ，內(nèi)管類SV40病毒型轉(zhuǎn)化載體腺病毒DNA末端結(jié)構(gòu)突出特點(diǎn)1）帶有1

23、00bp反向的末端重復(fù)序列（ITR）,而且在每一條單鏈的51末端還共價(jià)地連接著末端結(jié)合蛋白，對(duì)病毒的復(fù)制有重要作用。2）當(dāng)它從病毒顆粒中分離出來之時(shí)，便會(huì)自發(fā)地環(huán)化起來，爾后許多環(huán)形分子又聚合成多聚體從5,端開始依次是：5,長(zhǎng)末端重復(fù)序列（5-LTR）,帶有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列；psi序列，又稱巾序列，是病毒包裝所必須的信號(hào)序列；編碼病毒衣冗蛋白；？pol,編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶（Int）;?env,編碼病毒顆粒外層包裝蛋白：3長(zhǎng)末端重復(fù)序列（3，-LTR）,帶有polyA加尾信號(hào)序列。根據(jù)SV40DNA進(jìn)入敏感動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)方向,分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)包括與病毒感染相關(guān)的t抗原基因

24、（smallT-antigen）和T抗原基因（largeT-antigcn）等;含有BamHI等限制性內(nèi)切核腺病毒載體是目前最為廣泛應(yīng)用的基因載體，也是唯一基因藥物的載體雙鏈DNA的分子大小約為36kb.可應(yīng)用于1.基因治療2.表達(dá)真核基因3.研制疫苗一類含單鏈RNA的動(dòng)物病毒。它的基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。（1）在大多數(shù)情況下，反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因（one）都能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。2）反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圉相當(dāng)廣，包括無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。3）反轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因可得到有效表達(dá)。4）反轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效率高，而且不招致寄主細(xì)胞的死亡含有能夠被!?核

25、細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。有許多種動(dòng)物病毒，在英感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。有些動(dòng)物病毒具有控制自己復(fù)制的順式元件和反式作用首先構(gòu)建一個(gè)含多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)志的轉(zhuǎn)意質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有病毒基因組某段早期序列;然后將一個(gè)含有啟動(dòng)子一外源基因-polyA的表達(dá)盒插入到上述質(zhì)粒中腺病毒E/、E3或E4至右側(cè)的ITR區(qū)之間，構(gòu)建成載有外源基因的穿梭質(zhì)粒。載體的構(gòu)建：分離原病毒DNA-刪去部分序列一組入選擇性標(biāo)記基因、目的基因和調(diào)控元件一克隆到含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)的克隆載體一轉(zhuǎn)化大腸桿菌一獲得反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體一輔助細(xì)胞系（包裝細(xì)胞系）一擴(kuò)增猿猴空泡病毒40（Simianvacuolatingvirus40,SV40）基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA,其大小僅有5243bp，很適于基因操作。導(dǎo)致人體癌變的可能性