公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第4部分_公共用品用具微生物

1、Q/LB.XXXXX-XXXXICS 點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)CCS C51中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18204.42022代替 GB/T18204.4-2013公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第4部分:公共用品用具微生物Examination methods for public places - Part 4:Microorganism on a surface of public articles(點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí))（本草案完成時(shí)間：2021.12.31）XXXX - XX - XX發(fā)布XXXX - XX - XX實(shí)施GB/T 18204.42022目次前言II1 范圍12

2、 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語(yǔ)和定義14 菌落總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法25 大腸菌群發(fā)酵法46 金黃色葡萄球菌平皿鑒定法77 真菌總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法108 -溶血性鏈球菌培養(yǎng)法13附錄A（規(guī)范性） 質(zhì)量控制和生物安全17附錄B（規(guī)范性） 公共場(chǎng)所公共用品用具微生物采樣方法 1819前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。GB/T 18204公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法分為六個(gè)部分：第1部分：物理因素；第2部分：化學(xué)污染物； 第3部分：空氣微生物；第4部分：公共用品用具微生物；第5部分：集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)；第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范。本文件為GB/T18204的

3、第4部分。本文件替代GB/T 18204.42013 公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第4部分：公共用品用具微生物。本文件與GB/18204.42013相比，主要技術(shù)變化如下：增加了“規(guī)范性引用文件”；修改了部分培養(yǎng)基和試劑；修改了部分材料和儀器設(shè)備；完善了樣品稀釋和培養(yǎng)的描述；修改了計(jì)算規(guī)則和結(jié)果報(bào)告的描述；完善了金黃色葡萄球菌的鑒定步驟，增加了血漿凝固酶試驗(yàn)；完善了-溶血性鏈球菌的鑒定步驟，增加了觸酶試驗(yàn)、鏈激酶試驗(yàn)及其他檢驗(yàn)方法；增加了質(zhì)量控制和生物安全的措施。修改了附錄B的表述請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)提出。

4、本文件由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、常州市疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、蘇州市疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所本文件主要起草人：丁震、周連、馬愷、馬小瑩、徐斌、王鳳鳴、沈強(qiáng)、雍瑋、周志榮、張付剛、趙瑩、范華鋒公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第4部分:公共用品用具微生物1 范圍1.1 GB/T 18204 的本部分規(guī)定了公共場(chǎng)所公共用品用具菌落總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和-溶血性鏈球菌的采樣與檢驗(yàn)方法。1.2 本部分適用于公共場(chǎng)所內(nèi)公共用品用具中菌落總數(shù)、真菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和-溶血性鏈

5、球菌的檢驗(yàn)，其他場(chǎng)所可參照?qǐng)?zhí)行。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 4789.28 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB 19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1 菌落總數(shù) total bacterial count 公共用品用具經(jīng)過(guò)采樣處理，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)36±1、48h培養(yǎng)所生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫性需氧和兼性厭氧菌落的總數(shù)。3.2 大腸菌群 c

6、oliforms一群在37、24h培養(yǎng)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。3.3 金黃色葡萄球菌 staphylococcus aureus在 Baird-Parker 平板或血平板上生長(zhǎng)良好，分解甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性的革蘭氏陽(yáng)性葡萄狀球菌。3.4 真菌總數(shù) total fungi count在孟加拉紅或沙氏瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)2528、3 d7 d培養(yǎng)所形成菌落的總數(shù)。3.5 -溶血性鏈球菌 -streptococcus hemolyticus 屬于鏈球菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性菌，分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在血平板上其菌落周圍形成一個(gè)24 mm寬的透明溶血環(huán)。4 菌落總

7、數(shù)平皿計(jì)數(shù)法4.1 培養(yǎng)基與試劑4.1.1 無(wú)菌生理鹽水4.1.1.1 成分：氯化鈉 8.5 g蒸餾水 1000 mL4.1.1.2 制法：稱取8.5 g氯化鈉溶于1000 mL蒸餾水中，分裝到試管內(nèi)，每管10 mL，121高壓滅菌15 min。4.1.2 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基4.1.2.1 成分：胰蛋白胨 5 g酵母浸膏2.5 g葡萄糖 1.0 g瓊脂 15.0 g蒸餾水 1000 mL4.1.2.2制法：將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝試管或錐形瓶，121高壓滅菌15 min。4.2 儀器和設(shè)備4.2.1高壓蒸汽滅菌器。4.2.2干熱滅菌箱。4.2.

8、3恒溫培養(yǎng)箱：36±1。4.2.4恒溫水浴箱：46±14.2.5冰箱：2-5。4.2.6電爐或微波爐。4.2.7天平：感量0.1 g。4.2.8渦旋混合器。4.2.9無(wú)菌試管：18 mm×150 mm。4.2.10無(wú)菌平皿：直徑90 mm。4.2.11無(wú)菌刻度吸管：1 mL（0.01 mL刻度）。4.2.12微量移液器：1000 L。4.2.13滅菌棉拭子。4.2.14滅菌剪刀。4.2.15pH計(jì)或精密pH試紙。4.2.16放大鏡或（和）菌落計(jì)數(shù)器。4.3 檢驗(yàn)步驟4.3.1 采樣方法見附錄B。4.3.2 樣品的稀釋：將放有采樣后棉拭子的生理鹽水試管在渦旋混合器上

9、充分振搖，此液為1：10的樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。按同法制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用1次1 mL無(wú)菌吸管或吸頭。4.3.3 樣品的接種：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇1個(gè)2個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1 mL生理鹽水稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平血作空白對(duì)照。4.3.4 樣品的培養(yǎng)：及時(shí)將15

10、mL20 mL冷卻至4550的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46±1恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ±1培養(yǎng)48h±2h。4.4 菌落計(jì)數(shù)4.4.1 可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量（CFU）。4.4.2 選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)，每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。4.4.3 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平

11、板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。4.4.4 平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界限），應(yīng)將每條鏈（不同來(lái)源）作為一個(gè)菌落計(jì)。4.5 不同稀釋度菌落計(jì)數(shù)計(jì)算規(guī)則4.5.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為樣本中菌落總數(shù)。4.5.2 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，則樣本中菌落總數(shù)按式（1）計(jì)算，示例見表1。 N=C(n1+0.1n2)d .(1) 式中：N 樣本中菌落總數(shù)，單位為CFU；C 平板（含適

12、宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，單位為CFU；n1 適宜范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低）平板個(gè)數(shù)；n2 適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高）平板個(gè)數(shù)；d 稀釋因子（第一稀釋度）。表1 兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)稀釋度1：100（第一稀釋度）1：1000（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35N=232+244+33+352+0.1x2x10-2=5442.2x10-2=24727上述數(shù)據(jù)經(jīng)“四舍五入”后，表示為25000或2.5×104。4.5.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

13、4.5.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.5.5 若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.5.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU之間，其中一部分大于300 CFU或小于30 CFU時(shí)，則以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.6 結(jié)果報(bào)告4.6.1 公共用品用具菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果按式（2）得出。A=T×bk .(2) 式中:A 一定面積的菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果（杯具以CFU/cm2為單位報(bào)告，其它公共用品用具以CFU/25cm2為單位報(bào)告。結(jié)果非整數(shù)

14、時(shí)，四舍五入保留整數(shù)）；T 平板平均菌落數(shù)，單位為CFU；b 稀釋倍數(shù)；k 根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)（杯具的系數(shù)k為實(shí)際采樣面積，其它公共用品用具的系數(shù)k為1）。（若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，則4.5.2中的N值為公式2中的T×b值）4.6.2 如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用檢測(cè)值高的結(jié)果報(bào)告。5 大腸菌群發(fā)酵法5.1 培養(yǎng)基和試劑5.1.1 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液5.1.1.1 成分 蛋白胨 20 g豬膽鹽（或牛、羊膽鹽） 5 g乳糖 10 g溴甲酚紫水溶液（質(zhì)量濃度0.04） 25 mL蒸餾水 1000 mL5.1.1.2 制法

15、將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于蒸餾水中，調(diào)pH至7.4，加溴甲酚紫溶液，混勻，分裝到帶有倒管的試管中，每管10 mL，經(jīng)115 高壓滅菌20 min。注： 雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。5.1.2 伊紅美藍(lán)瓊脂5.1.2.1 成分蛋白胨 10 g乳糖 10 g磷酸氫二鉀 2 g瓊脂 17 g伊紅水溶液（質(zhì)量濃度2） 20 mL美藍(lán)水溶液（質(zhì)量濃度-0.5） 10 mL蒸餾水 1000 mL5.1.2.2 制法將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH至7.2分裝到燒瓶?jī)?nèi)。經(jīng)115 高壓滅菌20 min，臨用時(shí)加入乳糖并加熱熔化瓊酯，冷至5055 ，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平皿

16、。5.1.3 乳糖發(fā)酵管5.1.3.1 成分蛋白胨 20 g乳糖 10 g溴甲酚紫水溶液（質(zhì)量濃度0.04） 25 mL蒸餾水 1000 mL5.1.3.2 制法將蛋白胨及乳糖溶于蒸餾水中，調(diào)pH至7.4，加入指示劑，分裝到帶有倒管的試管中，每管3 mL，經(jīng)115 高壓滅菌20 min。5.1.4 革蘭氏染色液。5.1.4.1 結(jié)晶紫染色液 5.1.4.1.1 成分 結(jié)晶紫 1 g 乙醇（95%，體積分?jǐn)?shù)） 20 mL 草酸銨水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)=1%） 80 mL 5.1.4.1.2 制法 將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。 5.1.4.2 革蘭氏碘液 5.1.4.2.1 成分 碘

17、 1 g 碘化鉀 2 g 蒸餾水 300 mL 5.1.4.2.2 制法 將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水。5.1.4.3 脫色劑乙醇（95%，體積分?jǐn)?shù)）。5.1.4.4 沙黃復(fù)染液 5.1.4.4.1 成分 沙黃 0.25 g 乙醇（95%，體積分?jǐn)?shù)） 10 mL 蒸餾水 90 mL 5.1.4.4.2 制法 將沙黃溶解于乙醇中,待完全溶解后加入蒸餾水。 5.2 儀器和設(shè)備5.2.1高壓蒸汽滅菌器。5.2.2干熱滅菌箱。5.2.3恒溫培養(yǎng)箱：36±1。5.2.4冰箱：2-5。5.2.5電爐或微波爐。5.2.6天平：感量0.1g。5.2.7 渦

18、旋混合器。5.2.8無(wú)菌接種環(huán)：直徑3 mm。5.2.9無(wú)菌試管: 18 mm×150 mm。5.2.10無(wú)菌平皿：直徑90 mm。5.2.11無(wú)菌刻度吸管：10 mL（0.1 mL刻度）。5.2.12滅菌棉拭子。5.2.13滅菌剪刀。5.2.14pH計(jì)或精密pH試紙。5.2.15顯微鏡。5.3 檢驗(yàn)步驟5.3.1 采樣方法見附錄B5.3.2 乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)：將檢樣（多于1 mL）倒入雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中。置36±1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h±2 h，觀察是否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，如不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣則為大腸菌群陰性。若有產(chǎn)氣產(chǎn)酸者，則按下列步驟進(jìn)行。5.3.3 分離培養(yǎng)：自產(chǎn)

19、酸、產(chǎn)氣發(fā)酵管中取一接種環(huán)培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)種伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h24 h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，典型菌落形態(tài)為深紫黑色、具有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色、中心較深。5.3.4 在上述平板上，挑取典型菌落1個(gè)2個(gè)做革蘭氏染色。（1）將培養(yǎng)18 h24 h的培養(yǎng)物涂片（2）將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1 min，水洗。（3）滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。（4）滴加乙醇脫劑，搖動(dòng)玻片，直至無(wú)紫色脫落為止，約30 s，水洗。（5）滴加復(fù)染液，復(fù)染1 min，水洗，待干，鏡檢。5.3.5 挑取典型菌落接種乳糖發(fā)酵管，置36±

20、;1培養(yǎng)24 h±2 h。5.4 結(jié)果報(bào)告凡乳糖發(fā)酵管最終產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，即可報(bào)告檢出大腸菌群。如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。6 金黃色葡萄球菌平皿鑒定法6.1 培養(yǎng)基和試劑6.1.1 胰酪胨大豆肉湯6.1.1.1 成分胰酪胨（或胰蛋白胨） 17 g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3 g氯化鈉 100 g磷酸氫二鉀 2.5 g葡萄糖 2.5 g蒸餾水 1000 mL6.1.1.2 制法將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2，分裝，每支9 mL，121 高壓滅菌15 min。6.1.2 7.5% 氯

21、化鈉肉湯6.1.2.1 成分蛋白胨 10 g牛肉膏 3 g氯化鈉 75 g蒸餾水 1000 mL6.1.2.2 制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝，每支9 mL，121 高壓滅菌15 min。6.1.3 Baird-Parker平板6.1.3.1 成分胰蛋白胨 10 g牛肉膏 5 g酵母浸液 1 g丙酮酸鈉 10 g甘氨酸 12 g氯化鋰（LiCl·6H2O） 5 g瓊脂 20 g蒸餾水 950 mL6.1.3.2 增菌劑的配制30%卵黃鹽水50 mL與過(guò)濾除菌后的1%亞碲酸鉀溶液10 mL混合，保存于4 冰箱內(nèi)。6.1.3.3 制法將6.1.3.1中各

22、成分混合，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至25 ，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝，每瓶95 mL，121 高壓滅菌15 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，冷卻至50 ，每95 mL加入預(yù)熱至50 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5 mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在4冰箱儲(chǔ)存，不得超過(guò)48 h。 6.1.4 血瓊脂平板6.1.4.1 成分營(yíng)養(yǎng)瓊脂 100 mL脫纖維羊血（或兔血） 10 mL 6.1.4.2 制法將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱熔化，待冷卻至50 左右以無(wú)菌操作加入滅菌脫纖維羊血（或兔血），搖勻，傾注平板，置于4 冰箱備用。 6.1.5 腦心浸出液肉湯6.1.5.1 成分胰蛋白胨 10 g

23、氯化鈉 5 g磷酸氫二鈉（12H2O） 2.5 g葡萄糖 2 g牛心浸出液 500 mL6.1.5.2 制法加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝，每支5 mL，121高壓滅菌15 min。6.1.6 營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面6.1.6.1 成分 蛋白胨 10 g牛肉膏 3 g氯化鈉 5 g瓊脂 1520 g蒸餾水 1000 mL6.1.6.2 制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2 mL調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2。然后加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂熔化，分裝至13 mm×130 mm試管，121 高壓滅菌15 min。6.1.7 兔血漿6.1.7.

24、1 成分檸檬酸鈉 3.8 g蒸餾水 100 mL兔全血 4 份6.1.7.2 制法將檸檬酸鈉溶于蒸餾水后過(guò)濾，裝瓶，121高壓滅菌15 min。取滅菌后3.8%檸檬酸鈉溶液1份，加兔全血4份，混勻靜置（或以3000 rpm/min離心30 min），使血細(xì)胞下沉，取上面血漿。6.1.8 革蘭氏染色液見5.1.4。6.2 儀器和設(shè)備6.2.1高壓蒸汽滅菌器。6.2.2恒溫培養(yǎng)箱：36 ±1 。6.2.3恒溫水浴箱：36 ±1 。6.2.4 電爐或微波爐 6.2.5天平：感量0.1 g。6.2.6無(wú)菌接種環(huán)：直徑3 mm。6.2.7無(wú)菌試管：18 mm×150 mm，

25、13 mm×130 mm。6.2.8無(wú)菌平皿：直徑 90 mm。 6.2.9 無(wú)菌刻度吸管：1 mL（0.01 mL刻度）、10 mL（0.1 mL刻度）。6.2.10 微量移液器：1000 L。6.2.11 pH計(jì)或精密pH試紙。6.2.12 顯微鏡 6.2.13 載玻片。6.2.14 酒精燈。6.2.15 生物安全柜。6.2.16 離心機(jī)。6.3 操作步驟6.3.1 采樣方法見附錄B。6.3.2 增菌：取1 mL樣品接種到9 mL 7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯中，于36±1培養(yǎng)18 h24 h。金黃色葡萄球菌在上述培養(yǎng)基中呈混濁生長(zhǎng)。6.3.3 分離：自上述增菌培

26、養(yǎng)基中，取12接種環(huán)培養(yǎng)物，劃線接種至Baird-Parker平板或血平板，于36 ±1 培養(yǎng)18 h24 h，觀察記錄菌落特征，Baird-Parker平板必要時(shí)可將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至45 h48 h。在Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌菌落呈圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)，菌落直徑為2 mm3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，邊緣整齊、常為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。偶有不分解脂肪的菌株，除沒(méi)有混濁帶和透明帶之外，其他外觀基本相同。在血平板上菌落較大，呈圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)，顏色呈金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍見完全透明的溶血環(huán)。6.3.4 革蘭氏染色鏡檢：挑取典型菌落，

27、涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜。 6.3.5 血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個(gè)可疑菌落（小于5個(gè)全選），分別接種到5 mL腦心浸出液肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36±1培養(yǎng)18 h24 h。取新鮮配制的兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入腦心浸出液肉湯培養(yǎng)物0.2 mL0.3 mL，振蕩搖勻，置于36±1培養(yǎng)箱或水浴箱內(nèi)，每30 min觀察一次，在6 h內(nèi)觀察結(jié)果。如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)用已知血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰

28、性菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說(shuō)明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。如結(jié)果可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落接種到5 mL腦心浸出液肉湯，于36±1培養(yǎng)18 h48 h，重復(fù)試驗(yàn)。6.4 結(jié)果報(bào)告綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。7 真菌總數(shù)平皿計(jì)數(shù)法7.1 培養(yǎng)基與試劑7.1.1 無(wú)菌生理鹽水見4.1.1。7.1.2 孟加拉紅培養(yǎng)基成分蛋白胨 5 g 葡萄糖 10 g磷酸二氫鉀 1 g 硫酸鎂( MgSO4·7H2O） 0.5 g瓊脂 20 g 氯霉素 0.1 g 蒸餾

29、水 1000 mL 孟加拉紅水溶液(質(zhì)量濃度=1:3000) 100 mL 制法：將蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和瓊脂溶于蒸餾水中，再加人孟加拉紅溶液，分裝后121高壓滅菌20 min，待冷至55左右加入氯霉素。7.1.3 沙氏瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨 10 g 葡萄糖 40 g 瓊脂 20 g 氯霉素 0.1 g 蒸餾水 1000 mL制法：將蛋白胨、葡萄糖和瓊脂溶于蒸餾水中，分裝后121高壓滅菌15 min，,待冷至55左右加入氯霉素。7.2 儀器和設(shè)備7.2.1高壓蒸汽滅菌器。 7.2.2恒溫培養(yǎng)箱：2528。7.2.3冰箱：2-5。7.2.4電爐或微波爐。7.2.5天平：感量0.1

30、g。7.2.6渦旋混合器。7.2.7無(wú)菌試管：18 mm×150 mm。7.2.8無(wú)菌平皿：直徑90mm。7.2.9無(wú)菌刻度吸管：1 mL（0.01 mL刻度）。7.2.10pH計(jì)或精密pH試紙。7.2.11放大鏡或（和）菌落計(jì)數(shù)器。7.3 檢驗(yàn)步驟7.3.1 采樣方法見附錄 B。7.3.2 樣品的稀釋：參照4.3.2。7.3.3 樣品的接種：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的評(píng)估，選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1 mL無(wú)菌稀釋液加人2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。7.3.4 樣品的培養(yǎng)：將溶化并冷卻至45左右的孟

31、加拉紅培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿約20 mL25 mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后，正置平皿于2528培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5天，3天后開始觀察，若真菌數(shù)量過(guò)多可于第3天計(jì)數(shù)結(jié)果，并記錄培養(yǎng)時(shí)間，否則于第5天記錄結(jié)果。7.4 菌落計(jì)數(shù)7.4.1 可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量（CFU）。7.4.2 通常選擇菌落數(shù)在5 CFU50 CFU之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。真菌蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平皿的可記錄為菌落蔓延。7.5 不同稀釋度菌落計(jì)數(shù)計(jì)算規(guī)則7.5.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)

32、，作為樣本中真菌總數(shù)。7.5.2 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)參照4.5.2的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行計(jì)算。7.5.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于50 CFU，對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.5.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于5 CFU，應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.5.5 若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.5.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在5 CFU50CFU之間，其中一部分大于50CFU或小于5 CFU時(shí)，則以最接近5 CFU或50 CFU的平均菌落數(shù)乘

33、以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.6 結(jié)果報(bào)告7.6.1 公共用品用具真菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果按式（3）得出。A=T×bk .(3) 式中:A 一定面積的真菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果（以CFU/50cm2為單位報(bào)告。結(jié)果非整數(shù)時(shí)，四舍五入保留整數(shù)）；T 平板平均菌落數(shù)，單位為CFU；b 稀釋倍數(shù)；k 根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)（如采樣面積50cm2，則k=1；如采樣面積25cm2，則k=1/2）。（若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，則4.5.2中的N值為公式3中的T×b值）7.6.2 如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用檢測(cè)值高的結(jié)果報(bào)告。8 -溶血性鏈球菌培養(yǎng)法

34、8.1 培養(yǎng)基和試劑 8.1.1胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB） 成分： 胰蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸二氫鉀（無(wú)水） 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 蒸餾水 1000.0 mL 制法：將上述各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121滅菌15 min，分裝備用。8.1.2改良胰蛋白胨大豆肉湯（Modified tryptone soybean broth, mTSB）8.1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆肉湯 TSB）見8.1.1 8.1.2.2抗生素溶液 多黏菌素溶液 稱取10

35、mg多黏菌素B于10 mL滅菌蒸餾水中，振搖混勻，充分溶解后過(guò)濾除菌。 萘啶酮酸鈉溶液 稱取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖混勻，充分溶解后過(guò)濾除菌。 8.1.2.3完全培養(yǎng)基 成分： 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB） 1000.0 mL 多黏菌素溶液 10.0 mL 萘啶酮酸鈉溶液 10.0 mL 制法：無(wú)菌條件下，將上述各成分進(jìn)行混合，充分混勻，分裝備用。 8.1.3哥倫比亞CNA血瓊脂（Columbia CNA blood agar） 8.1.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分： 胰酪蛋白胨 12.0 g 動(dòng)物組織蛋白消化液 5.0 g 酵母提取物 3.0 g 牛肉提

36、取物 3.0 g 玉米淀粉 1.0 g 氯化鈉 5.0 g 瓊脂 13.5 g 多黏菌素 0.01 g 萘啶酸 0.01 g 蒸餾水 1000.0 mL 制法：將上述各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121滅菌12 min。 8.1.3.2無(wú)菌脫纖維綿羊血無(wú)菌操作下條件下，將綿羊血加入到盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約10 min，靜置后除去附有血纖維的玻璃珠即可。8.1.3.3完全培養(yǎng)基成分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 000.0 mL 無(wú)菌脫纖維綿羊血 50 mL制法：當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50左右時(shí)，無(wú)菌操作加入50 mL脫纖維綿羊血，搖勻后傾注平板。8.1.4血瓊脂平板：

37、見6.1.4。8.1.5革蘭氏染色液：見5.1.4。8.1.6草酸鉀血漿成分：草酸鉀 0.01 g 人血 5.0 mL 制法：草酸鉀0.01 g放入滅菌小試管中，再加入5 mL人血，混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液即為草酸鉀血漿。 8.1.7 0.25氯化鈣（CaCl2）溶液成分： 氯化鈣（無(wú)水） 22.2 g 蒸餾水 1000.0 mL 制法：稱取22.2g氯化鈣（無(wú)水）溶于蒸餾水中，分裝備用。 8.1.8 3過(guò)氧化氫（H2O2）溶液 成分：30過(guò)氧化氫（H2O2）溶液 100.0 mL 蒸餾水 900.0 mL 制法：吸取100mL 30過(guò)氧化氫(H2O2)溶液，溶于蒸餾水中，混勻，分裝備用。

38、 8.1.9生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。 8.2 設(shè)備和材料 8.2.1高壓蒸汽滅菌器。8.2.2 恒溫培養(yǎng)箱：36±1。8.2.3恒溫水浴箱：36±1。8.2.4 厭氧培養(yǎng)裝置。8.2.5冰箱：25。 8.2.6電爐或微波爐。8.2.7 天平：感量0.1 g8.2.8無(wú)菌試管：18 mm×150 mm。8.2.9無(wú)菌平皿：直徑90 mm。8.2.10 無(wú)菌刻度吸管：1 mL（0.01 mL刻度）、10 mL（0.1 mL刻度）。8.2.11 微量移液器：1000 L。8.2.12 無(wú)菌錐形瓶：容量200 mL、500 mL、1000 mL、2000 mL。8.2

39、.13 pH計(jì)或精密pH試紙。8.2.14 顯微鏡8.2.16 載玻片。 8.2.16 離心機(jī)8.2.17微生物生化鑒定系統(tǒng)。8.3 操作步驟 8.3.1 采樣方法見附錄B。8.3.2 樣品增菌及分離培養(yǎng)，取1 mL液體檢樣，加入9 mL改良胰蛋白胨大豆肉湯，36±1培養(yǎng)18 h24 h。接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36±1厭氧培養(yǎng)18 h24 h，觀察菌落形態(tài)。-溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約2 mm4mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊，在菌落周圍形成完全透明的溶血環(huán)，紅細(xì)胞完全溶解。8.3.3 鑒定 8.3.4 分純

40、培養(yǎng)：挑取哥倫比亞CNA血瓊脂平板上5個(gè)（如小于5個(gè)則全選）可疑菌落分別接種血瓊脂平板和TSB增菌液，36±1培養(yǎng)18 h24 h。8.3.5 革蘭氏染色鏡檢：挑取血瓊脂平板上可疑菌落染色鏡檢。-溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，呈球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。 8.3.6 觸酶試驗(yàn)：挑取血瓊脂平板上可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%過(guò)氧化氫溶液，于半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性，-溶血性鏈球菌觸酶為陰性。 8.3.7 鏈激酶試驗(yàn)：吸取草酸鉀血漿0.2 mL于0.8 mL滅菌生理鹽水中混勻，再加入經(jīng)36±1培養(yǎng)18 h24 h的可疑菌的TSB培養(yǎng)液0.5

41、 mL及0.25%氯化鈣溶液0.25 mL，振蕩搖勻，置于36±1水浴中10 min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置時(shí)內(nèi)容物不流動(dòng)）。繼續(xù)36±1培養(yǎng)24 h，凝固塊重新完全溶解為陽(yáng)性，不溶解為陰性，-溶血性鏈球菌為陽(yáng)性。 8.3.8 其他檢驗(yàn)：使用商品化生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。 8.4 結(jié)果報(bào)告綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出或未檢出-溶血性鏈球菌。如果一件用品采兩份樣品，若兩份樣品檢測(cè)結(jié)果不一致，采用陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。AA附錄A （規(guī)范性）質(zhì)量控制和生物安全A.1 培養(yǎng)基和試劑需符合GB 4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培

42、養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求，購(gòu)買國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的成品培養(yǎng)基需有中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的生產(chǎn)文號(hào)，對(duì)于購(gòu)買的成品培養(yǎng)基，應(yīng)在培養(yǎng)基有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按照培養(yǎng)基要求的貯存條件進(jìn)行保存。A.2 確保所用試劑和材料為無(wú)菌狀態(tài)，操作過(guò)程中避免人為污染。A.3 實(shí)驗(yàn)用水的電導(dǎo)率在25時(shí)不應(yīng)超過(guò)25 S/cm(相當(dāng)于電阻率0.4cm)，除非另有規(guī)定要求。水的微生物污染不應(yīng)超過(guò)103 CFU/mL。A.4 實(shí)驗(yàn)室生物安全應(yīng)符合GB 9489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)人員在處理或檢測(cè)可疑致病菌時(shí)應(yīng)采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施，減少職業(yè)暴露，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的要求

43、。BB附錄B （規(guī)范性）公共場(chǎng)所公共用品用具微生物采樣方法B.1 范圍本附錄規(guī)定了公共場(chǎng)所公共用品用具微生物采樣的基本要求。B.2 一般要求B.2.1 隨機(jī)抽取清洗消毒后準(zhǔn)備使用的公共用品用具。B.2.2 采樣過(guò)程中應(yīng)無(wú)菌操作。B.2.3 采樣步驟：使用滅菌干燥棉拭子，于10 mL滅菌生理鹽水內(nèi)浸潤(rùn)（吸取約1 mL溶液）后，在用品用具的適當(dāng)部位來(lái)回均勻涂抹進(jìn)行樣品采集，將采集樣品后的棉拭子放人剩余的9 mL生理鹽水內(nèi)，用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸的部分，4 h內(nèi)送檢。B.3 采集部位與采樣面積B.3.1 杯具在茶具內(nèi)、外緣與口唇接觸處，即1 cm2 cm 高處采樣一圈。計(jì)算并記錄采樣面積。B.3.2 棉織品B.3.2.1 將毛巾、枕巾、浴巾先對(duì)折后展開，在展開平面上，取對(duì)折線兩側(cè)中央對(duì)稱位置5cm×5cm（25cm2）面積范圍內(nèi)分別均勻涂抹5次，每25cm2采樣面積為1份樣品，每件用品共采集2份樣品。B.3.2.