陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的體外培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移

1、陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的體外培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞基因陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的體外培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移作者：張林，郝兆芹 作者單位：(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，陜西西安 710061)【摘要】 目的 觀察非病毒載體陽(yáng)離子聚合物(SofastTM)介導(dǎo)的編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的 pEGFPN1 和 pIREEGFP 兩種質(zhì)粒對(duì)體外培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞(RCEC)的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞 Na+K+ATPase 活性變化，探索最優(yōu)的體外 RCEC 非病毒載體基因轉(zhuǎn)移條件。方法 消化法原代培養(yǎng) RCEC，SofastTM 與 pEGFPN1 和 pIREEGFP 兩種質(zhì)粒按不同比例混

2、合，介導(dǎo)此兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 RCEC，分別比較各質(zhì)粒不同時(shí)間的轉(zhuǎn)染效率，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 Na+K+ATPase 的活性以確定基因轉(zhuǎn)移對(duì) RCEC 活性的影響。結(jié)果SofastTM 與質(zhì)粒(pEGFPN1 和 pIREEGFP)按不同比例轉(zhuǎn)染 RCEC 后，24-48h均有 EGFP 的表達(dá)。SofastTMpEGFPN1=3.21 組在轉(zhuǎn)染后 48h 時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高(P0.05)，為 3.6%。SofastTMpIREEGFP=3.21 組在轉(zhuǎn)染后 24h 時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高(P0.05)，為 3.5%。轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞Na+K+ATPase 活性均無(wú)明顯差異。結(jié)論 SofastTM

3、 可有效介導(dǎo)以 pEGFPN1和 pIREEGFP 為載體的外源基因向體外培養(yǎng)的 RCEC 轉(zhuǎn)移，且基因轉(zhuǎn)移后 RCEC活性不受影響?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】 角膜內(nèi)皮細(xì)胞角膜內(nèi)皮細(xì)胞; ;陽(yáng)離子聚合物陽(yáng)離子聚合物; ;基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移;Na+;Na+K+K+ATPaseATPaseTransferring gene to rabbit corneal endothelial cellsin vitroby cationic polymerZhang Lin, Hao Zhaoqin(Department of Ophthalmology, the First AffiliatedHospital

4、,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061,China)ABSTRACT: Objective To observe the transfection efficiency oftransferring plasmids pEGFPN1 and pIREEGFP encoding enhancedgreen fluorescent protein (EGFP) to rabbit corneal endothelial cells(RCECs) by cationic polymer and the change of ce

5、ll activity bydetecting the activity of Na+K+ATPase. Methods RCEC was culturedby digestion and identification by neurone specific enolase(NSE)stain. Sofast TM mediated plasmid pEGFPN1 and pIREEGFP totransfect RCECs and we compared the transfection efficiency atdifferent time and in different groups

6、by calculating the number offluorescent cells. We observed the activity change of transfectionand nontransfection RCEC by detecting the activity ofNa+K+ATPase. Results After pEGFPN1 and pIREEGFP transfectedRCEC with Sofast TM by different ratio, RCEC expressed EGFP in 24-48h.After transfection 48h t

7、he group of SofastTMpEGFPN1=3.21 hadthe max transfection efficiency 3.6% and the max transfectionefficiency of group SofastTMpIREEGFP =3.21 was 3.5%, at 24hafter transfection. There were no obvious differences between thetransfection and nontransfection groups of cell number and activityof Na+K+ATPa

8、se. Conclusion Sofast TM can mediate exogenous genetrasfering to RCEC effectively. pEGFPN1 and pIREEGFP are thesuitable nonvirus vectors for gene transferring to RCECs.KEY WORDS: corneal endothelial cells; cationic polymer; genetransfer; Na+K+ATPase角膜內(nèi)皮層是位于角膜內(nèi)面的細(xì)胞單層，是角膜基質(zhì)與房水的分界，其屏障及泵功能對(duì)于保持角膜的透明性、基質(zhì)的

9、脫水狀態(tài)及角膜正常厚度起著關(guān)鍵作用。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(human corneal endothelial cell, HCEC)增殖能力有限，如何有效提高 HCEC 的增殖是進(jìn)行 HCEC 移植和構(gòu)建組織工程化角膜12的關(guān)鍵。基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可將外源基因轉(zhuǎn)入正常細(xì)胞，通過(guò)外源基因的表達(dá)來(lái)改變細(xì)胞的一些生理特性，進(jìn)而達(dá)到促細(xì)胞增殖、診斷和治療疾病的目的，正逐步應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) SofastTM 介導(dǎo)編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的 pEGFPN1 和 pIREEGFP 兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞(rabbit

10、corneal endothelial cell, RCEC)，觀察外源基因在 RCEC 的表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組 RCEC Na+K+ATPase 活性的變化，探討最優(yōu)的體外 RCEC 非病毒基因轉(zhuǎn)移條件，為進(jìn)一步將有促 HCEC 增殖和治療功能的外源基因?qū)?HCEC 奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康新西蘭白兔 40 只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重 1.5-2.0kg，均無(wú)眼疾，雌雄兼?zhèn)洹?.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒 pEGFPN1 和 pIREEGFP 為天津醫(yī)科大學(xué)李曦銘博士惠贈(zèng)。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司。SofastTM 轉(zhuǎn)染試

11、劑購(gòu)自廈門太陽(yáng)馬公司。RPMI 1640 購(gòu)自 GIBCO。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。考馬斯藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、超微量 ATP 酶測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所提供。CO2 培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、手握式細(xì)胞勻漿器、722 分光光度計(jì)均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科提供。1.3 RCEC 體外培養(yǎng) 將兔經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死后立即取出眼球，無(wú)菌條件下剪除眼球周圍組織，慶大霉素生理鹽水(400u/mL)沖洗，然后浸泡于慶大霉素生理鹽水中 4保存。30min 后轉(zhuǎn)入無(wú)菌間，在超凈工作臺(tái)內(nèi)的解剖顯微鏡下，于角膜緣內(nèi)

12、 1mm 處 360環(huán)形剪取角膜片，內(nèi)皮面向上至培養(yǎng)皿中，沿角膜片邊緣揭取后彈力層，內(nèi)皮面向上置于預(yù)置 PBS 的另一培養(yǎng)皿中，經(jīng) PBS 漂洗后移入消化液(2.5g/L 胰蛋白酶和 0.2g/L EDTA 11 混合)中，37孵育 20-25min，倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞松散，間隙變寬，部分脫落時(shí)，加入含 FBS的培養(yǎng)基終止消化，吹打使細(xì)胞脫落，將后彈力層剪碎后繼續(xù)吹打，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞已吹開，后彈力層已無(wú)細(xì)胞黏附時(shí)收集細(xì)胞懸液離心，1500 轉(zhuǎn)離心 15min，PBS 重懸后再離心，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，以 1105 個(gè) cell/mL接種 24 孔板。1.4 RCEC 的鑒定 原代

13、接種細(xì)胞達(dá)到 80%融合時(shí)，用胰酶消化后做細(xì)胞爬片，免疫組化 SABC 法進(jìn)行 NSE 染色，DAB 顯色，鏡檢觀察。1.5 轉(zhuǎn)染及外源基因的表達(dá) 原代接種細(xì)胞貼壁后 48h 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。SofastTM/DNA 按重量比 1.61、2.41、3.21、41 分別稀釋混合后加入各孔，每種比率 5 個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組分兩大組：一組為質(zhì)粒 pEGFPN1 組 (按比例由小到大分為 5 組);另一組為質(zhì)粒 pIREEGFP 組(分 5 組)。不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的 5孔為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后 24、48h 時(shí)，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。每孔隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)光鏡和倒置熒光顯微鏡下的細(xì)胞個(gè)數(shù)，然

14、后取平均值。1.6 Na+K+ATPase 活力的測(cè)定 將實(shí)驗(yàn)組中 EGFP 表達(dá)率最高的組與對(duì)照組細(xì)胞分別消化、離心，棄上清，留下層細(xì)胞，用 4生理鹽水制備成 105cells /mm3 勻漿，用勻漿器在冰上進(jìn)行破碎，制備細(xì)胞懸液備用。使用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定細(xì)胞懸液中蛋白含量。按照超微量 ATP 酶測(cè)試盒說(shuō)明書進(jìn)行ATP 酶檢測(cè)。按以下公式計(jì)算:蛋白含量(g/L)=(測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)管質(zhì)量濃度(g/L)。Na+K+ATPase 活力(u/mg prot)=(測(cè)定管 A值-對(duì)照管 A 值)(標(biāo)準(zhǔn)管 A 值-空白管 A 值)標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.1mol/mL)6勻漿蛋白含量(mg

15、prot/mL)。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0 軟件處理，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用s 表示，采用重復(fù)測(cè)量(Repeated measures)中最小顯著法(LSD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 結(jié)果2.1 倒置顯微鏡下觀察原代 RCEC 的生長(zhǎng)狀況 原代接種后 4-6h 細(xì)胞貼壁，呈圓形，胞漿透亮，核居中(圖 1);24-48h 細(xì)胞由圓形逐漸伸展變成不規(guī)則形;48h 后細(xì)胞逐漸變成規(guī)則的多邊性，核圓、居中，呈集落狀生長(zhǎng)(圖 2);至6-7d 時(shí)各集落融合成細(xì)胞單層，細(xì)胞排列緊密，呈典型的鋪路石樣(圖 3)。2.2 NSE 染色 RCEC 經(jīng) NSE 染色，蘇木素復(fù)染，DAB 顯色后，可見胞漿

16、內(nèi)粗大的棕色顆粒，胞核藍(lán)色，呈 NSE 陽(yáng)性表達(dá)(圖 4)。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)脊來(lái)源的 RCEC。2.3 外源基因的表達(dá)分析 因各孔接種細(xì)胞數(shù)相等，所以可用熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)代表轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢驗(yàn)，以下結(jié)果均以熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)為基礎(chǔ)。SofastTM 與質(zhì)粒(pEGFPN1 和 pIREEGFP)按不同比例轉(zhuǎn)染 RCEC 后，24-48h 均有 EGFP 的表達(dá)，對(duì)照組未見表達(dá) EGFP 的細(xì)胞。不同比例的 SofastTMpEGFPN1 各組間轉(zhuǎn)染效率存在差別(P0.001)，各組間多重測(cè)量表明 4.01 組與其他三組轉(zhuǎn)染率均有明顯差異(P0.001)，其他三組間的轉(zhuǎn)染率無(wú)明顯差異(P1.07

17、);不同時(shí)間，轉(zhuǎn)染效率不同(P0.001);分組與轉(zhuǎn)染時(shí)間間有交互作用(P0.05);SofastTM：pEGFPN1=3.21 組在轉(zhuǎn)染后 48h 時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，為3.6%(光鏡下每視野細(xì)胞計(jì)數(shù)平均為 200 個(gè))，其 95%可信區(qū)間為(6.859，9.541)(圖 5，表 1)。不同比例的 SofastTMpIREEGFP 各組間轉(zhuǎn)染效率存在顯著差異(P0.001)，各組間多重測(cè)量表明 3.21 組的轉(zhuǎn)染率與其他三組有顯著差異(P0.05)，其他三組間的轉(zhuǎn)染率無(wú)明顯差異(P0.181);不同時(shí)間，轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著差異(P=0.192);分組與轉(zhuǎn)染時(shí)間間有交互作用(P0.05，表 3)。表

18、2 pIREEGFP 組 24、48h 時(shí)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性 RCEC 數(shù)(略)Table 2 The number of transfection RCEC, after transfection 24hand 48h in pIREEGFP groupNote: Letter b indicates the group (SofastTMpIREEGFP=3.21)is different from the others表 3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞 Na+K+ATPase 活性(略)Table 3 The number of RCECs and the activity of Na+K+ATP

19、aseof RCECs in different groups*P0.05 vs. control3 討論角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cell, CEC)的體外培養(yǎng)方法已基本建立，較常用的有組織貼片培養(yǎng)法、揭膜法和酶消化法。組織貼片培養(yǎng)法最簡(jiǎn)單但易引起上皮和基質(zhì)細(xì)胞的混入，揭膜法獲得細(xì)胞純但易污染，消化法在角膜材料較多時(shí)可一次提供大量細(xì)胞，但易對(duì)細(xì)胞造成損傷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)消化法進(jìn)行了改良，采用單純消化配合剪切的方法既易于細(xì)胞自后彈力層脫落保證足夠的細(xì)胞量，又避免酶對(duì)細(xì)胞過(guò)度損傷。經(jīng)改良消化法原代培養(yǎng)的 RCEC 4-6h 貼壁，24-48h 時(shí) RCEC 由圓形逐漸伸展為

20、不規(guī)則的多邊形，48h 后變?yōu)橐?guī)則的多邊形，6-7d 融合成細(xì)胞單層，呈典型的鋪路石樣，胞漿透亮，核居中。雖然細(xì)胞未形成典型的六邊形形態(tài)，但研究3已證實(shí) RCEC 的活性與功能并不影響。NSE是神經(jīng)來(lái)源組織所表達(dá)的一種特異性酶4。大多學(xué)者認(rèn)為，CEC 來(lái)源于神經(jīng)脊，故可將 NSE 作為一種鑒定 CEC 的標(biāo)志酶。RCEC 經(jīng) NSE+蘇木素復(fù)染后，可見胞漿內(nèi)粗大的棕色顆粒，胞核呈藍(lán)色，呈 NSE 陽(yáng)性表達(dá)。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)脊來(lái)源的 CEC。HCEC 培養(yǎng)是進(jìn)行 HCEC 移植和構(gòu)建組織工程化角膜的基礎(chǔ)。因?yàn)?HCEC 體外增殖能力有限, 以往只是在培養(yǎng)基中添加促細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，

21、如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，但其促增殖效果并不理想。近年來(lái)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)正作為一種全新的方法，逐步應(yīng)用于試驗(yàn)研究及臨床疾病的診斷和治療?；蜣D(zhuǎn)移的載體有病毒與非病毒載體之分，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移多以病毒載體為主，如 Aboalchamat5和 Bwdnarz 等6先后用病毒載體將 SV40 T 抗原轉(zhuǎn)入 HCEC 獲得了永生化的 HCEC;隨后 Shin等7又用 HPV E6E7 原癌基因建立 RCEC 細(xì)胞系，并檢測(cè)到 Na+/K+ ATP 活性增高;Hsiao 等8用重組表達(dá) SV40 T/t 抗原的腺病毒載體轉(zhuǎn)染 HCEC，發(fā)現(xiàn)可提高創(chuàng)傷愈合力和增殖能力，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可

22、保留形態(tài)學(xué)特征;Liu 9等用重組腺病毒介導(dǎo)酸性成纖維生長(zhǎng)因子對(duì) HCEC 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)可顯著促進(jìn) CEC 的增殖能力;Tsai 等10發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型攜帶轉(zhuǎn)基因的腺相關(guān)病毒(rAAV)載體可穩(wěn)定攜帶轉(zhuǎn)基因，并對(duì) RCEC 功能無(wú)損傷。腫瘤病毒或致瘤病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但可使轉(zhuǎn)染細(xì)胞丟失一些生物學(xué)特性，并面臨致瘤的危險(xiǎn)，而非病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率低，但可保持細(xì)胞的正常生理功能。越來(lái)越多的學(xué)者將目光移到非病毒載體上。目前非病毒載體介導(dǎo)的對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移的有關(guān)報(bào)道大多用的是脂質(zhì)體，其原理是脂質(zhì)體與 DNA 質(zhì)粒利用它們之間的靜電作用形成復(fù)合體，此復(fù)合體再與細(xì)胞表面形成靜電作用，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。H

23、art 等11證明了脂質(zhì)體載體可以轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，但是其轉(zhuǎn)染效率較病毒載體低12。陽(yáng)離子聚合物工作原理類似于脂質(zhì)體,主要是在帶有陽(yáng)離子的聚合物和充有陰離子的 DNA 之間形成復(fù)合物，然后吸附到細(xì)胞表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)染效率也相對(duì)較低。但是陽(yáng)離子聚合物有利于保護(hù) DNA 免受內(nèi)核體的破壞13，且價(jià)格較低。因此本試驗(yàn)選用陽(yáng)離子聚合物 SofastTM。pEGFPN1 和 pIRESEGFP 均為較常用的攜帶外源基因的質(zhì)粒。pEGFPN1 適于攜帶較短基因片段而pIRES2EGFP 適于攜帶較大片斷，且二者都有報(bào)告基因 EGFP，可直接在熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因表達(dá)情況。本試驗(yàn)選用陽(yáng)離子聚

24、合物 SofastTM 介導(dǎo)pEGFPN1 和 pIRESEGFP 轉(zhuǎn)染 RCEC，結(jié)果表明其可有效介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染RCEC，轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量及 Na+K+ATPase 活性基本一致，證明陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移并不影響 RCEC 的生物學(xué)活性，無(wú)毒副作用，可用于 CEC 的基因轉(zhuǎn)移和治療。角膜內(nèi)皮基因轉(zhuǎn)移是角膜內(nèi)皮基因治療的基礎(chǔ)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)移對(duì)角膜移植前供體進(jìn)行基因修飾可提高 CEC 功能，降低術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生;通過(guò)基因轉(zhuǎn)移促進(jìn) CEC 增殖可直接體內(nèi)治療因角膜內(nèi)皮損傷所致的角膜病變，從而代替穿透性角膜移植術(shù)，降低排斥反應(yīng)，克服術(shù)后散光、新生血管以及供體不足等缺點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)方法的

25、建立，為進(jìn)一步尋找最佳基因轉(zhuǎn)入載體，開展 CEC 的基因轉(zhuǎn)移和治療打下良好基礎(chǔ)，對(duì) CEC 移殖的臨床應(yīng)用和角膜病的基因治療有很好的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Zieske JD, Mason VS, Wasson ME, et al. Basement membraneassembly and differentiation of cultured corneal cells: importance ofculture environment and endothelial cell interaction J. Exp CellRes, 1994, 214(2):621633.2Orwin E

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