缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用

1、缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用         08-01-13 16:31:00     編輯：studa20                    作者：褚薇薇，武步強(qiáng)，沙煥臣，王殿華 【摘要】  目的 探討缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用。方法 復(fù)

2、制SD大鼠腸缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為4組(n=8)：假手術(shù)組(S)、缺血再灌注組(I/R)、缺血預(yù)處理組(IPC)、缺血后處理組(Ipost)。比較各組大鼠腸黏膜丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性變化；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞凋亡發(fā)生率；Chius評(píng)分法觀察腸黏膜的損傷情況。結(jié)果 與I/R組相比，IPC組和Ipost組大鼠腸黏膜MDA含量和MPO活性均顯著降低，而SOD活性明顯升高；再灌注后可見(jiàn)明顯的腸黏膜細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Ipost組和IPC組凋亡指數(shù)較I/R組顯著下降，組織病理?yè)p傷亦明顯減輕。Ip

3、ost組和IPC組相比，各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異。結(jié)論 缺血后處理可通過(guò)抑制再灌注后氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生，保護(hù)抗氧化系統(tǒng)，從而抑制腸黏膜細(xì)胞凋亡，減輕腸缺血再灌注損傷。 【關(guān)鍵詞】  缺血再灌注；缺血后處理；缺血預(yù)處理；細(xì)胞凋亡；腸黏膜腸缺血再灌注損傷與臨床許多疾病和病理過(guò)程有密切關(guān)系，細(xì)胞凋亡在其損傷的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用12。1986年Murry等提出心肌在經(jīng)受多次短暫缺血再灌后，能在隨后的長(zhǎng)時(shí)間缺血中延遲并減輕心肌損傷，即缺血預(yù)處理。已證實(shí)，這一現(xiàn)象存在于不同種屬的不同組織器官中34。但由于這種預(yù)處理需在缺血前施予，從而使其臨床應(yīng)用價(jià)值受限。Zhao等5于2003年首先在心臟缺血再

4、灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究中證明，在再灌注一開(kāi)始采用數(shù)個(gè)循環(huán)的短暫的灌注/阻斷之后全面恢復(fù)心臟的再灌注，能對(duì)缺血再灌注心臟產(chǎn)生抗損傷作用，從而提出了一種新的外科干預(yù)措施缺血后處理。隨后的研究6也證實(shí)缺血后處理能夠縮小心肌梗死范圍，降低心律失常的發(fā)生率。這種缺血后處理對(duì)缺血再灌注器官的抗損傷作用是否具有普遍性，目前尚不能確定。因此，本研究擬通過(guò)復(fù)制大鼠腸缺血再灌注損傷模型，研究缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用，并探討其可能的機(jī)制，為腸缺血再灌注的臨床治療提供新的理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  主要試劑 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過(guò)氧化物酶

5、(MPO)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，原位凋亡檢測(cè)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠32只，體重230-280g，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，術(shù)前禁食12h，不禁水。1.2.1  動(dòng)物模型復(fù)制  腹腔注射200g/L烏拉坦(1g/kg)麻醉后，仰臥固定于操作板上，消毒后取腹正中切口長(zhǎng)約3cm進(jìn)腹，用溫鹽水紗布將腸管推向左側(cè)腹腔，暴露右腎內(nèi)上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery, SMA)，在其根部用無(wú)

6、創(chuàng)傷血管夾夾閉阻斷SMA血運(yùn)45min，造成腸缺血模型，然后松夾，再灌注1h后經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死。1.2.2  動(dòng)物分組及處理 動(dòng)物隨機(jī)分為4組(n=8)：假手術(shù)(S)組：僅行開(kāi)腹，分離SMA不夾閉；缺血再灌注(I/R)組：方法見(jiàn)模型復(fù)制；缺血預(yù)處理(IPC)組：夾閉SMA 5min和松夾5min作為預(yù)處理，2個(gè)循環(huán)，余同I/R組；缺血后處理(Ipost)組：缺血45min后即刻行3個(gè)循環(huán)的灌注30s/阻斷30s，余同I/R組。1.3  標(biāo)本收集 動(dòng)物被處死后，取小腸回盲部10cm以上的腸管。經(jīng)冰鹽水漂凈，濾紙吸干，沿腸管長(zhǎng)軸切開(kāi)，用載玻片輕輕刮取腸黏膜部

7、分，立即-70分裝凍存，2cm腸組織經(jīng)40g/L甲醛溶液固定，常規(guī)制備小腸全層組織石蠟切片，分別進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和常規(guī)HE染色。1.4  觀察項(xiàng)目 分光光度法測(cè)定腸黏膜MPO、SOD活性以及MDA含量。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。按Chiu氏六級(jí)評(píng)分分析，取平均值。TUNEL法檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞凋亡。按TUNEL試劑盒步驟進(jìn)行，以胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性。每張切片均在高倍鏡(400倍)視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目及總細(xì)胞數(shù)目。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。以5個(gè)視野的均值代表每只動(dòng)物的凋亡指數(shù)。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié) 果2.1  腸黏膜MDA含量和SOD、MPO活性的變化 與I/R組相比，Ipost組和IPC