RNA干擾作用的機(jī)制及應(yīng)用

1、RNA干擾作用的機(jī)制及應(yīng)用伊正君 朱道銀(重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室重慶400016摘要 RNA干擾是真核生物界普遍存在的由dsRNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。它具有高度的序列特異性、系統(tǒng)性和記憶性,可視為是由dsRNA介導(dǎo)的RNA水平上的序列特異的獲得性免疫反應(yīng)?；诖藱C(jī)制建立的RNAi技術(shù)作為新興的基因阻抑方法,在功能基因組學(xué)、微生物學(xué)、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)鍵詞 RNA干擾 基因沉默 獲得性免疫RNA干擾作用是一種同源性依賴的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(pos-t transcriptional gene silencing,PTGS?；虺聊侵干矬w中特定序列的外源

2、或內(nèi)源基因不能表達(dá),目前認(rèn)為基因沉默是真核生物界普遍具有的一種基因表達(dá)調(diào)控方式?；虺聊稍趦煞N水平上發(fā)生,一種是基于DNA甲基化、位置效應(yīng)及整合位點(diǎn)的異染色質(zhì)化等機(jī)制引發(fā)的轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默;另一種是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄后,通過(guò)使靶mRNA特異性降解或阻止其翻譯而使目的基因表達(dá)受到阻抑的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。1 RNA干擾作用的機(jī)制1.1 同源性依賴的基因沉默(homology-dependent gene silencing,HDGS是指與基因的同源性互作有關(guān)的基因沉默,如某些外源基因本身不表達(dá),同時(shí)還可導(dǎo)致受體細(xì)胞內(nèi)部相應(yīng)的同源性基因的表達(dá)也受到阻抑。HDGS在TGS、PTGS兩種水平上均可發(fā)

3、生。在PTGS水平上,雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA作為引發(fā)因子或中間體為不同生物基因沉默所共有。1998年Fire等描述了模式生物秀麗新小桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans中由dsRNA介導(dǎo)的PTGS現(xiàn)象并稱之為RNA干擾(RNA interference,RNAi。研究表明,植物的抗病毒作用以及共抑制現(xiàn)象(cosuppression、真菌的基因阻抑現(xiàn)象(quelling、動(dòng)物細(xì)胞(如小鼠、人胚腎細(xì)胞的RNA干擾現(xiàn)象、某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座失活等現(xiàn)象中,存在著共同的PTGS機(jī)制,都與雙鏈RNA引發(fā)的、同源性依賴的轉(zhuǎn)錄后基因沉默有關(guān)。為了抵御外來(lái)核酸

4、(如病毒侵襲以及轉(zhuǎn)座子等可轉(zhuǎn)移核酸的轉(zhuǎn)座,保護(hù)自身性狀和基因組的穩(wěn)定,細(xì)胞必須建立有效機(jī)制(如通過(guò)核酸酶降解、啟動(dòng)基因沉默機(jī)制等以清除或抑制這些外來(lái)序列。在DNA水平,主要通過(guò)DNA 甲基化、異染色質(zhì)化等機(jī)制發(fā)揮作用;在RNA水平,則主要通過(guò)RNA干擾作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此認(rèn)為RNA干擾是真核生物界普遍存在的一種對(duì)抗外源基因表達(dá)的免疫機(jī)制,本質(zhì)上是由dsRNA介導(dǎo)的RNA水平上的序列特異的獲得性免疫反應(yīng)1。關(guān)于RNA介導(dǎo)產(chǎn)生PTGS的具體機(jī)制,目前有RNA閾值模式、分子間堿基配對(duì)模式、異常RNA模式等多種假說(shuō)。各種模式統(tǒng)一于最終產(chǎn)生了雙鏈RNA 或發(fā)夾狀RNA(hairpin RNA,hpRNA,它

5、們由病毒、轉(zhuǎn)座子、重組基因等直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,或由其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的異常RNA(Aberrant RNA,aRNA激活RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP后產(chǎn)生,還可以是某些病毒復(fù)制時(shí)形成的雙鏈RNA中間體。沒(méi)有雙鏈RNA的正常細(xì)胞正是利用這些中間體來(lái)識(shí)別和抵御外來(lái)核酸入侵的;RNAi發(fā)生的后繼過(guò)程是,出現(xiàn)在細(xì)胞中的外源或內(nèi)源的dsRNA首先在類Rnase 型核酸酶(如Dicer作用下切割成小片段干擾RNA(smal-l interfering RNA,siRNA,這些siRNA與Dicer等蛋白質(zhì)結(jié)合生成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induc

6、ed silencing complex,RISC,其中的siRNA具有同源性依賴的引導(dǎo)功能,在siRNA的引導(dǎo)下,RISC被引導(dǎo)到有同源序列的靶mRNA并與之特異結(jié)合,隨后mRNA被切割降解。在此過(guò)程中,內(nèi)源基因的同源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也可被結(jié)合和降解,結(jié)果外源基因的導(dǎo)入使內(nèi)源和外源基因的表達(dá)共同受阻。RNAi效應(yīng)具有自我擴(kuò)增性,少量dsRNA即可發(fā)揮阻抑效應(yīng),能夠在細(xì)胞間傳遞,甚至將此效應(yīng)傳至下一代。Brenda等認(rèn)為在RNAi過(guò)程中包括RdRP介導(dǎo)的dsRNA擴(kuò)增反應(yīng),從而使PTGS具有持久性和系統(tǒng)性。1.2 支持以上結(jié)論的證據(jù)是,Hunter通過(guò)純化將RNA 合成過(guò)程中形成的dsRNA去除后,只

7、把正義或反義的單鏈RNA注入線蟲(chóng)卵中沒(méi)有產(chǎn)生預(yù)期的RNAi表型,但如果將這些單鏈RNA混合退火復(fù)性后得到dsRNA 再注入線蟲(chóng)卵中則可以產(chǎn)生顯著的RNA干擾現(xiàn)象,這表明RNAi是由于dsRNA的存在而引起的;Hamil ton等在發(fā)生PTGS的植物中分離到了一種25個(gè)核苷酸左右的與被沉默基因同源的RNA片段,未發(fā)生PTGS的植物中則不能檢出,推測(cè)即是由RdRP聚合產(chǎn)生的cRNA 片段;利用遺傳學(xué)方法,在不同物種中篩選鑒定出多種RNAi所必需的基因,同源性比較表明,它們所編碼的蛋白質(zhì)與植物中的RdRP具有高度的同源性,RdRP是RNAi作用中的關(guān)鍵酶之一,它參與催化dsRNA的生成112003年

8、第38卷第5期 生 物 學(xué) 通 報(bào)和大量擴(kuò)增;Berns tein等2則從果蠅中成功地分離出能特異性切割dsRNA的進(jìn)化保守的RNase 家族核酸酶 Dicer ,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它具備RNA干擾核酸酶所定義的全部功能,即雙鏈RNA的結(jié)合、解螺旋和對(duì)RNA的切割降解作用,從另一角度提供了直接證據(jù)。2 RNA i基因阻抑技術(shù)RNA干擾技術(shù)系指,利用外源導(dǎo)入或轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的雙鏈RNA介導(dǎo)受體細(xì)胞中序列特異的同源性靶mRNA發(fā)生降解或翻譯受阻,引發(fā)受體細(xì)胞產(chǎn)生PTGS,使與此相應(yīng)的內(nèi)源靶基因表達(dá)被阻抑,從而得到類似于 基因敲除 的基因阻抑效果。它包括用于干擾的iRNA(interfering R

9、NA片段的設(shè)計(jì)與合成、iRNA的標(biāo)記、iRNA的轉(zhuǎn)染、RNA干擾效果的檢測(cè)等步驟。RNAi作用是歸結(jié)于dsRNA的存在而引發(fā)的,所以RNAi技術(shù)中的RNA一般是設(shè)計(jì)成雙鏈的;dsRNA的長(zhǎng)度也是影響干擾效應(yīng)的重要參數(shù),對(duì)非哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言,較長(zhǎng)的dsRNA(>100bp阻抑效果較強(qiáng)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,較長(zhǎng)(>30bp的d sRNA由于誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的干擾素系統(tǒng)和激活了RNA依賴的蛋白激酶(PKR,產(chǎn)生的抑制作用是廣泛的、非特異性的,小干擾RNA(2123bp才可以在此類細(xì)胞中誘導(dǎo)出可重復(fù)的、序列特異的RNA干擾作用3,因此應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的不同設(shè)計(jì)雙鏈RNA的長(zhǎng)度;RNAi是在轉(zhuǎn)錄后水

10、平上運(yùn)作的,只含內(nèi)含子序列的dsRNA理論上無(wú)法引發(fā)RNA干擾,同時(shí)所設(shè)計(jì)的dsRNA必須要與靶基因有較高的同源性以保證對(duì)其他無(wú)關(guān)序列的表達(dá)和同基因家族的成員無(wú)干擾作用;同一靶mRNA選不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)產(chǎn)生的RNA干擾效果亦有較大差異4;可見(jiàn)dsRNA 的設(shè)計(jì)與合成是RNAi技術(shù)中關(guān)鍵性的一步。dsRNA的合成包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法等。用于RNAi技術(shù)的RNA可以是dsRNA,也可以是單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNAs,shRNAs。Kennerdell等發(fā)現(xiàn)如果將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA引入受體細(xì)胞則可以產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳,或者將反式重復(fù)的外源基因轉(zhuǎn)入

11、受體細(xì)胞中使其形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也能實(shí)現(xiàn)基因沉默的穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法是利用DNA質(zhì)粒為載體,導(dǎo)入受體細(xì)胞中,經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后生成siRNA,優(yōu)點(diǎn)是可以和其他帶選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,無(wú)須另外合成寡核苷酸片段,且可保證持久和穩(wěn)定地表達(dá)siRNA,從而打破了傳統(tǒng)方法必須提前合成siRNA和短暫性兩個(gè)限制,使RNAi技術(shù)真正成為了可被廣泛采用的有力工具5。dsRNA的標(biāo)記一般采用熒光標(biāo)記法,可對(duì)RNAi作用的過(guò)程及結(jié)果進(jìn)行示蹤和觀察。針對(duì)不同的研究目的和對(duì)象,dsRNA的轉(zhuǎn)染可采用顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電穿孔法、浸泡法、飼喂法等。RNA干擾作用的檢測(cè)可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?從整體水

12、平(生物表型分析、細(xì)胞水平(免疫熒光法定位和示蹤、表達(dá)水平( Western和轉(zhuǎn)錄水平(Northern全方位、多層次進(jìn)行檢測(cè)。3 研究R NA干擾機(jī)制及其技術(shù)的理論和實(shí)踐意義3.1 功能基因組學(xué)研究:利用RNAi技術(shù)可以做逆向基因分析,即在已知某生物基因序列后,有目的性地運(yùn)用RNAi技術(shù)針對(duì)一段特定的基因進(jìn)行干擾,使之不能表達(dá),繼而出現(xiàn)功能或個(gè)體表型的改變。則這段基因序列在該生物基因組中的功能即可明確。RNAi現(xiàn)象的普遍性使之成為強(qiáng)有力的反向遺傳學(xué)研究工具,利用該技術(shù)可以產(chǎn)生大量的缺陷型個(gè)體并可對(duì)大量的表型模擬的突變體進(jìn)行生化分析,可用于遺傳育種、胚胎發(fā)育研究6等。3.2 應(yīng)用于微生物學(xué)研究

13、:隨著后基因組時(shí)代的來(lái)臨,明確各基因的功能及其調(diào)控機(jī)理已經(jīng)成為研究前沿。在對(duì)基因組龐大、組成復(fù)雜的微生物進(jìn)行分析時(shí), RNAi技術(shù)開(kāi)辟了一種新奇而高效的捷徑,由于它的高度序列特異性,使同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行功能分析并探求它們之間的相互作用關(guān)系和協(xié)同效果成為可能。深入研究RNA干擾的作用機(jī)理使人們對(duì)微生物感染與免疫的認(rèn)識(shí)打破了蛋白質(zhì)水平的局限,建立了核酸免疫的概念,目前發(fā)現(xiàn)某些病毒的抗性不是由蛋白質(zhì)而是由RNA介導(dǎo)的,這種抗性稱為RNA介導(dǎo)的病毒抗性。Dvaid等認(rèn)為在動(dòng)物中RNAi代表一種古老的抗病毒反應(yīng),與植物的PTGS一樣是抵抗病毒感染的有效辦法。Sharp發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中dsRNA能夠通

14、過(guò)以上機(jī)制引發(fā)對(duì)病毒的抗性,產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,長(zhǎng)片段的RNA只需少量即可引起非特異性的干擾素反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,而短片段的siRNA則可以引發(fā)序列特異性的RNA干擾作用。由此可以認(rèn)為dsRNA使核酸水平上的非特異性免疫和特異性免疫統(tǒng)一了起來(lái)。于此相反,Marx發(fā)現(xiàn)有些病毒在進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)獲得了抑制宿主沉默的基因,Voinnet等已在植物病毒中發(fā)現(xiàn)了多種RNA沉默抑制蛋白并證明它們是病毒的致病因子。通過(guò)RNAi技術(shù)研究這些對(duì)抗機(jī)制以及對(duì)抗過(guò)程中啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、相關(guān)基因開(kāi)閉的調(diào)控方式等,有望發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療微生物感染,尤其是某些病毒感染的新方法。Coburn等7利用siRNA產(chǎn)生

15、RNA干擾作用抑制HIV-1的Tat和Rev蛋白的表達(dá),有效抑制了HIV病毒在培養(yǎng)的人T細(xì)胞中的基因表達(dá)和復(fù)制。12生 物 學(xué) 通 報(bào) 2003年第38卷第5期中國(guó)青少年生長(zhǎng)變化存在問(wèn)題和干預(yù)措施季成葉(北京大學(xué)兒童青少年衛(wèi)生研究所北京100083伴隨社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高,我國(guó)青少年正經(jīng)歷深刻的生長(zhǎng)長(zhǎng)期變化(secular growth shift。因起步晚,目前總體生長(zhǎng)水平較低,但增長(zhǎng)潛力很大。本文通過(guò)描繪中國(guó)青少年近15年來(lái)的生長(zhǎng)變化,提出改善策略和措施,以提高我國(guó)跨世紀(jì)一代人的生活質(zhì)量。所用資料來(lái)自1985年、1995年和2000年全國(guó)學(xué)生體質(zhì)調(diào)研,均有數(shù)十萬(wàn)人參加,隨機(jī)抽樣自全國(guó)

16、所有省區(qū)市,在反映中國(guó)青少年生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)最具代表性1。通常分城鄉(xiāng)、男女4組分析生長(zhǎng)發(fā)育現(xiàn)狀,但因城鄉(xiāng)不同群體間因社會(huì)經(jīng)濟(jì)不同而導(dǎo)致的差異很大,所以在部分分析中,將全國(guó)青少年按分層原則,歸納成4個(gè)群體: 大城市 ,(占總數(shù)17%, 中小城市 (占13%, 富裕農(nóng)村 (占20%, 中下水平鄉(xiāng)村 ,(占50%2。1 中國(guó)青少年19852000年期間體格迅猛增長(zhǎng)1.1 身高近15年來(lái)增長(zhǎng)迅速。以718歲平均增幅計(jì),城市男孩、城市女孩、鄉(xiāng)村男孩、鄉(xiāng)村女孩分別增長(zhǎng)4.2cm、3.1cm、4.8cm和3.7cm。鄉(xiāng)村青少年生長(zhǎng)基數(shù)低,身高增幅超過(guò)城市。如將19852000年分兩階段,可發(fā)現(xiàn)前10年的身高增幅較

17、快,城市男孩、城市女孩、鄉(xiāng)村男孩、鄉(xiāng)村女孩分別增長(zhǎng)3cm、2.2cm、3.5cm和2.8cm,主要表現(xiàn)為青春期突增提前。以突增高峰年齡為例,13歲城市男孩從153.7cm增長(zhǎng)到158.7cm,增幅5cm;鄉(xiāng)村男孩從148.4cm增長(zhǎng)到153.8cm,增幅5.4cm。12歲城市女孩從147.6cm增長(zhǎng)到151.7cm,鄉(xiāng)村女孩從142.5cm增長(zhǎng)到147.5cm,增幅分別為4.1和5cm。當(dāng)今的13歲男生和12歲女生,身高分別相當(dāng)于15年前的13.7歲男生和12.6歲女生。后5年中城市男孩、城市女孩、鄉(xiāng)村男孩、鄉(xiāng)村女孩平均身高分別增長(zhǎng)2.5cm、1.9cm、2.5cm和1.9cm。也主要表現(xiàn)為青

18、春期提前,但增幅較前10年略低。這5年的突出表現(xiàn)是,1618歲(青春后期階段增幅顯著超過(guò)前10年。城市男孩、城市女孩增幅超過(guò)前10年一倍;鄉(xiāng)村男孩、鄉(xiāng)村女孩增幅略小,但也分別超過(guò)前10年50%和30%。這和1995年以來(lái)國(guó)民經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)迅速、人民在生活和營(yíng)養(yǎng)上取得更大的實(shí)惠有關(guān)。前10年的青春期提前趨勢(shì)是發(fā)達(dá)國(guó)家生長(zhǎng)長(zhǎng)期趨勢(shì)的早期共有的,伴隨城市化、工業(yè)化趨勢(shì)自然發(fā)生;后5年的身高增長(zhǎng)具有更強(qiáng)有力的物質(zhì)基礎(chǔ)(如優(yōu)良蛋白質(zhì)攝入增加,將促進(jìn)成年身高顯著提高,充分展現(xiàn)中國(guó)人的生長(zhǎng)潛力,因而更具實(shí)質(zhì)意義。15年來(lái)體重的增幅比身高更驚人,也有青春期提前的明顯表現(xiàn)。城市男孩、城市女孩、鄉(xiāng)村男孩、鄉(xiāng)村女孩7歲體

19、重分別從1985年的21.5kg、20.6kg、20.3kg 和19.6kg增長(zhǎng)到達(dá)2000年的24.6kg、23.1kg、22.2kg 和21.3kg。該4群體13歲體重分別從1985年的40.2 kg、41.2kg、37.4kg和39.5kg增長(zhǎng)到2000年的47.8 kg、45.1kg、42.3kg和41.8kg;18歲體重分別從1985年的56.4kg、49.6k g、55.8kg和50.5kg增長(zhǎng)到2000年的61.6kg、51.8kg、58.1kg和51.0k g。3.3 用于基因治療、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)8、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究等領(lǐng)域:RNAi作用具有高特異性、高效性,因此可以用于基因治療

20、;利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在特定時(shí)期針對(duì)特定組織細(xì)胞對(duì)目的基因進(jìn)行阻抑,使精確研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理成為可能,如用于分析細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的基因表達(dá)及其調(diào)控等?？傊?隨著RNAi機(jī)制研究的深入和RNA干擾技術(shù)的日趨完善,它作為一種便捷實(shí)用的基因研究工具,在眾多領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1 邵先安,熊思東.基因沉默:獲得性免疫的新途徑.生命的化學(xué),2001,21(6:462 464.2 Berns tei n E,Caudy A A,Hammond S M et al.Role for a biden-tate ri bonuclease in the ini tiation step of RNA i nterference.Na-ture,2001,409(6818:363 366.3 Oshiumi H,Be gum NA,Matsumoto M e t al.RN A interferencefor mammalian cells.Nippon Yakurigaku Zass hi,2002,120(2:91 95.4 Holen T,A marzguioui M,Wii ger MT et a