TTV核酸模板快速制備方法

1、TTV核酸模板快速制備方法              作者：蘇明權(quán) ，馮繼紅 ，于文彬，徐光華 ，馬越云，張建芳 ，張林，劉家云 【關(guān)鍵詞】  TT病毒關(guān)鍵詞: TT病毒;聚合酶鏈反應(yīng);核酸制備 摘 要:目的  尋求建立適合大批量臨床標(biāo)本檢測(cè)TT病毒（TTV）核酸快速制備方法，直接用于PCR擴(kuò)增. 方法  應(yīng)用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法與直接快速裂解法，分別制備TTV核酸做PCR模板，用于TTV的聚合酶鏈反應(yīng)的快速檢測(cè). 結(jié)果 

2、 在30例非甲非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患者血清，應(yīng)用經(jīng)典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法，分別制備TTV核酸模板，在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果兩種制備方法的符合率為89%. 結(jié)論  TTV是一種新發(fā)現(xiàn)的肝炎病毒，目前主要以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病毒核酸的存在為診斷依據(jù)，建立了具有快速、簡(jiǎn)便、適合大批量臨床標(biāo)本中TTV核酸制備方法，對(duì)TTV肝炎的快速診斷，具有重要的意義.     Rapid preparation of transfusion transmitted virus nucleic acid template 

3、    SU Ming-Quan     1 ，F(xiàn)ENG Ji-Hong     2 ，YU Wen-Bin     1 ，XU Guang-Hua     2 ，MA Yue-Yun     1 ，ZHANG Jian-Fang     1 ，ZHANG Lin     1 ，LIU J

4、ia-Yun     1    1 Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an710033，China，2 Deparment of Infectious Diseases，College of Medicine，Yan'an University，Yan'an716000     Keywords:transfusi

5、on transmitted virus;polymerase chain reaction;DNA preparation     Abstract:AIM To establish a method adapting to rapid preparation of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nucleic acid template was prepared for PCR using two methods，viz.hydroxybenzene chloro-form extract

6、ion and directly rapid cracking.RESULTS DNA abstracted by the two methods was amplified at same PCR parameter and the coincidence rate was89%.CONCLUSION TTV is a new discovered hepatitis virus and the main laboratory diagnosis method is to detect it's DNA by PCR，so it is very important to establ

7、ish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples.     0 引言     TT病毒是近年新發(fā)現(xiàn)的一種肝炎病毒，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一種新的病原性相關(guān)病毒因子時(shí)，建立一種敏感、快速、特異的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法并評(píng)價(jià)該病毒因子在肝病中的價(jià)值是十分重要的，該方法的臨床適用性和可行性，是評(píng)價(jià)所建立方法在臨床上應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵所在.目前主要以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病毒核酸的存在為診斷依據(jù)，建立具有快速、簡(jiǎn)便、適合大批量臨床標(biāo)本中TTV核酸制備方法，對(duì)TTV肝炎的快速診斷，具有重

8、要的意義.我們從臨床快速檢測(cè)需要為目的，尋求建立一種快速、簡(jiǎn)便的TTV核酸制備方法，用于大批量臨床標(biāo)本的檢測(cè)，獲得滿意的結(jié)果.     1 材料和方法     1.1 材料  非甲非庚型肝炎血清30例，來(lái)自延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院傳染科;慢性乙型肝炎患者血清50例，來(lái)自西京醫(yī)院就診患者;引物及合成:根據(jù)Nishizawa等1 報(bào)道的引物，外引物:RD037（正義鏈）5'-GCAGCAGCATATGGATATGT-3'RD038（反義鏈）5'-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3

9、9;，擴(kuò)增片段:270bp;內(nèi)引物:RD051（正義鏈）5'-ATACA-CATGAATGCCAGGC-3'RD052（反義鏈）5'-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3'擴(kuò)增片段:196bp，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成.     1.2 方法 蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法:50L血清加200L裂解液（50mmolL-1 Tris-HCl pH8.0，200mmolL -1 NaCl，10mmolL-1 EDTA，20gL-1 SDS，1gL-1 蛋白酶K），60水浴60min，加等體積酚:氯仿:異戊醇（25241

10、）混勻，4冰浴下30min，2000g離心10min，取上清加等體積預(yù)冷無(wú)水乙醇-20過(guò)夜，1000g離心20min，沉淀溶于20L0.1×TE緩沖液中，備用.直接快速制備法:20L血清加50L快速裂解液（50mmolL-1 Tris HCl，pH8.0，50mmolL1 KCl，1.5mmolL-1 MgCl，10gL -1 NP-40，5gL-1 Tween-205gL-1 Triton X-100，2.0gL-1 SDS）煮沸20min，1000g離心10min，取上清做模板.PCR擴(kuò)增:第1輪PCR擴(kuò)增:總反應(yīng)體積為25L，包括:10×PCR緩沖液2.5L;4×dNTP2.0L;外引物各1.0L（50pmolL -1 ）;DNA模板5.0L;Taq DNA酶3UL-1 ;無(wú)菌蒸餾水12.5L;無(wú)菌石蠟油30L覆蓋液面，94變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)條件:9450s，5550s，7270s，32個(gè)循環(huán)，最后72延伸5min.第2輪PCR擴(kuò)增:總反應(yīng)體積為25L，包括:10×PCR緩沖液2.5L;4×dNTP2.0L;內(nèi)引物各1.0L（50pmolL-1 ）;第1次PCR產(chǎn)物5.0L;Taq DNA