VEGF單克隆抗體對胰腺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響

1、VEGF單克隆抗體對胰腺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響         11-03-24 13:10:00     編輯：studa20                   作者：楊家紅 謝嶸 王瑩 范昕【摘要】  目的： 從胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的角度探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單克隆抗體

2、在胰腺缺血再灌注損傷中保護(hù)作用。方法： 采用鉗閉大鼠腹腔干、腸系膜上動(dòng)脈制備胰腺缺血再灌注損傷模型，并應(yīng)用細(xì)胞凋亡原位標(biāo)記法(TUNEL)、免疫組化技術(shù)等檢測VEGF單克隆抗體干預(yù)后對胰腺細(xì)胞凋亡及Bax,Bcl2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果： 干預(yù)組15，30，60 min胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于缺血再灌注組(P<0.01)。正常胰腺組織未見凋亡調(diào)控基因Bcl2的表達(dá), VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bcl2染色陽性率明顯高于缺血再灌注組(P<0.01)；正常胰腺組織見較弱的凋亡調(diào)控基因Bax的表達(dá)，而VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Ba

3、x染色陽性率明顯低于缺血再灌注組(P<0.01)。結(jié)論： VEGF單克隆抗體能夠通過抑制胰腺腺泡細(xì)胞的過度凋亡減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度，該作用可能是通過促進(jìn)抗凋亡Bcl2基因表達(dá)，抑制促進(jìn)凋亡基因Bax表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】  胰腺； 缺血再灌注； 細(xì)胞凋亡； VEGF單克隆抗體； Bax； Bcl2    Abstract  Objective: To investigate the effect of VEGF McAb  protecting on pancreas injury during experimental i

4、schemic/reperfusion in rats.Methods： Ischemic/reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and the celica artery of 70 rats.Apoptosis of pancreatic acinar cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiot in nick end labeling(TUNEL) method,

5、and the expression of apoptosis regulated gene Bax and Bcl2 was detected by immunohistochemical technique. Results： The index of apoptosis increased significantly in pancreatic tissues after pancreatic ischemia/reperfusion injury but  offset by administration of VEGF McAb.Immunohistochemical an

6、alysis showed that just weak Bax staining cells were detected, with no Bcl2 positive staining cells in normal pancreatic tissues.The positive rate of Bcl2 protein in VEGF McAb group was significantly higher than ischemic/reperfusion group while the positive rate of Bax was significantly lower(all P&

7、lt;0.01). Conclusion： VEGF McAb treatment alleviated pancreatic ischemia/reperfusion injury by restraining excessive apoptosis.This effect might be related with upregulating the expression of Bcl2 and downregulating the expression of Bax.    Key words  pancrease;   isch

8、emic/reperfusion;   apoptosis;   VEGF McAb;   Bax;   Bcl2    缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是一種常見的臨床病理生理過程，在急性胰腺炎(AP)的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系1，現(xiàn)已證實(shí)，AP大鼠的發(fā)病過程中胰腺存在細(xì)胞凋亡的改變，且與其病變的嚴(yán)重程度有關(guān)2。本實(shí)驗(yàn)旨在探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體在I/R損傷后對胰腺細(xì)胞凋亡的影響及其

9、可能的機(jī)制，以探討AP治療的新途徑。    1  材料與方法    1.1  動(dòng)物及主要試劑    清潔級SD大鼠共70只，雌雄不限（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），VEGF單克隆抗體（Santa Cruz 公司），鼠抗Bcl2單克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）、兔抗Bax單克隆抗體（Santa Cruz公司），鏈霉素親生物素過氧化物酶標(biāo)(SP)免疫組化試劑盒(Biotech公司產(chǎn)品)。    1.2  方  法 

10、60;  1.2.1  動(dòng)物分組  成年Wistar大鼠70只，隨機(jī)分為對照組(10只)、缺血再灌注損傷組(30只)和VEGF單抗干預(yù)組(30只)，其中缺血再灌注損傷組和VEGF單抗干預(yù)組再分為15，30，60 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，每組10只。    1.2.2  動(dòng)物模型制作  術(shù)前12 h禁食不禁水， 0.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切開，找到腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈。對照組不用血管鋏鉗閉腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈，直接取胰腺組織標(biāo)本，心臟穿刺取血2 ml；缺血再灌注損傷組和VEGF單克隆抗體干預(yù)

11、組分別以血管夾阻斷腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈15，30，60 min(各10只)后再灌注6 h，取胰腺組織標(biāo)本。    1.2.3  干預(yù)及處理  VEGF單克隆抗體干預(yù)組于術(shù)前5 min 尾靜脈注射VEGF單克隆抗體100  g/300 g，缺血再灌注損傷組僅注射等量生理鹽水。    1.3  胰腺組織的檢測    1.3.1  胰腺細(xì)胞凋亡的檢測  按Boenger Manheim公司試劑盒說明操作，光鏡下觀察計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)計(jì)算方法:數(shù)4個(gè)高倍視野，分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%    1.3.2  免疫組化SP法檢測胰腺組織細(xì)胞凋亡基因  胰腺組織常規(guī)石蠟切片， 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，胰蛋白酶液消化，室溫20 min。以下步驟按SP試劑盒說明操作， 光鏡下計(jì)算胰腺細(xì)胞Bax,Bcl2染色陽性率。結(jié)果判斷: 細(xì)胞染色呈棕褐色或棕黃色為陽性，Bax,Bcl2