生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)口試題目及要點(diǎn)參考(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1、物質(zhì)分離純化的總體思路是什么？在進(jìn)行生物大分子的分離純化時(shí)應(yīng)該注意什么？答：1）物質(zhì)分離純化的總體思路是：首先我們要建立一種靈敏的檢測手段來檢測待分離物質(zhì)，之后根據(jù)待分離物質(zhì)與其所處體系中其他物質(zhì)的特性及差異來探求分離純化的方法，力求所用步驟最少、每一步的純化率最高、回收率最好，最后對提純的物質(zhì)進(jìn)行檢測以確定該物質(zhì)是否達(dá)到提純要求。2）生物大分子都具有一定的空間結(jié)構(gòu)，而維持空間結(jié)構(gòu)的正是那些次級鍵（非共價(jià)鍵），這些次級鍵非常不穩(wěn)定，容易遭到破壞，在對生物大分子進(jìn)行分離純化操作時(shí)保證這些鍵不被破壞，即保證其活性。因此，操作時(shí)需要在合適的條件下進(jìn)行操作（低溫、使用緩沖

2、液），另外要加入抗氧化還原的物質(zhì)或者蛋白酶抑制劑避免其發(fā)生氧化還原反應(yīng)及被酶分解，總之，不能夠破壞其結(jié)構(gòu)與活性。2、為什么對生物體系的同一類甚至同一物質(zhì)會有不同的含量測定方法？在實(shí)際工作中如何選擇？答：生物體系是復(fù)雜的，也是未知的。我們根據(jù)生物體系中待測物質(zhì)的物理或化學(xué)特性來建立含量的測定方法，如可針對待測物質(zhì)的某一化學(xué)基團(tuán)來進(jìn)行含量檢測，而在整個(gè)生物體系中，也有許多的其他物質(zhì)具有這一性質(zhì)，它們具有共性，如此一來，這樣的非待測物質(zhì)就會成為含量測定的干擾因素，影響結(jié)果的可靠度。人們開始尋找更為可信的方法，去尋找針對其他理化性質(zhì)建立測定方法，從而產(chǎn)生了多種含量測定方法。但是生物大分子之間的共性非常

3、多，所以方法總是有或多或少的干擾因素（可舉例說明）。在實(shí)際工作中，我們應(yīng)該選擇干擾因素小的方法。根據(jù)自己的工作需要，如精度要求、可重復(fù)性等，來選擇合適的方法。3、酶活力測定的總體思路是什么？為什么該類測定中都有所謂對照管的設(shè)計(jì)？對照管的設(shè)計(jì)要注意什么？答：1）酶活測定的總體思路是在最適條件下，測定酶促反應(yīng)初速度。2）由于測定酶活時(shí)，目標(biāo)酶常常處于一個(gè)生物體系內(nèi)，該體系較為復(fù)雜，為了確保我們所測的酶活為目標(biāo)酶的酶活，需要設(shè)計(jì)對照管來消除干擾及影響。設(shè)計(jì)對照管排除非酶促反應(yīng)階段酶促反應(yīng)的影響。在設(shè)計(jì)對照管時(shí)，要注意除其不發(fā)生目標(biāo)酶的酶促反應(yīng)外，其他外界條件均要與測定管一致，如底物含量，反應(yīng)條件等。

4、4、在生物化學(xué)研究中，為什麼一般均要使用緩沖液？在使用緩沖液時(shí)應(yīng)注意哪些問題？答：1）生物化學(xué)研究的對象生物大分子多為兩性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等，拿蛋白質(zhì)來說，其結(jié)構(gòu)單元是氨基酸，氨基酸是兩性的，它的某些基團(tuán)的解離狀態(tài)是受到pH影響的，“結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)決定功能”，這就導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能受到影響。對于研究工作來說，多數(shù)需要測定生物大分子在特定活性下的特性，因此需要固定pH。當(dāng)然，緩沖液就具有維持和穩(wěn)定特定pH的特定，所以常選用緩沖液。2）在使用緩沖液時(shí)，一要注意根據(jù)目標(biāo)物特性選擇合適的緩沖范圍；二要考慮緩沖液組分和待測組分不能發(fā)生相互作用或者化學(xué)反應(yīng)。比如：緩沖液組分有可能是酶的激活劑或

5、者抑制劑。再如，常用的磷酸緩沖液，在進(jìn)行與ATP相關(guān)的實(shí)驗(yàn)時(shí)就不能使用，因?yàn)锳TP水解產(chǎn)生磷酸根，會對緩沖液組分有所影響。5、眾多測定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均采取鈍化b-淀粉酶的活力而測a-淀粉酶和測總酶活力的策略，極少看到采取鈍化a-淀粉酶活力去測b-淀粉酶的活力，為什么？這種設(shè)計(jì)思路說明什麼？答：1）采取鈍化b-淀粉酶的活力而測a-淀粉酶活力，在70時(shí)鈍化b-淀粉酶，使其完全失去活性，此后采取驟冷處理方式，升溫至40時(shí)，又不會恢復(fù)其活性。而鈍化a-淀粉酶，在pH3.7條件下鈍化，使a-淀粉酶變性，等到恢復(fù)待測定酶活最適pH時(shí)，a-淀粉酶則有可能會復(fù)性。此外，調(diào)節(jié)pH時(shí)一般需要使用緩沖液

6、，那么就要考慮到緩沖液中的組分（如某些離子）有可能是所測酶的激活劑或者抑制劑，這樣一來所測酶的活性就不準(zhǔn)確了。相比較而言，溫度變量是容易控制的，而且高溫對a-淀粉酶活性基本無影響，卻對b-淀粉酶有較好的鈍化作用，并且在測定過程中我們沒有引入其他的影響因子。2）說明在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，要注意考慮方法的可行性、科學(xué)性以及相關(guān)因素的干擾。6、紫外法測定RNA含量時(shí)，為什么要固定測定液的pH值，若pH值不固定，會影響測定結(jié)果嗎？為什么？答：在測定RNA含量之前需用2%氨水調(diào)pH7.0。這樣做的原因有以下幾個(gè)：（1）核酸在過酸或者過堿條件下，雙螺旋區(qū)會發(fā)生氫鍵斷裂，紫外吸收升高，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此外在不

7、同pH溶液中，嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收也隨之表現(xiàn)出明顯的差異。而紫外法通過測定OD260值來計(jì)算RNA含量，因此需要排出相關(guān)變量對紫外吸收的影響。（2）核酸的摩爾消光系數(shù)（比消光系數(shù)）（）并不是一個(gè)確定的值，而是依賴于材料的前處理、溶液的pH 和離子強(qiáng)度發(fā)生變化，其經(jīng)典數(shù)值均是在pH = 7.0條件下測得的，故使用比消光系數(shù)法測RNA含量時(shí)需要調(diào)節(jié)pH7.0。（3）生理pH7.0條件下有利于核酸的溶解，使核酸樣品盡可能多的溶解，測定結(jié)果更準(zhǔn)確（次要原因）。7、利用分子篩層析分離物質(zhì)時(shí)，流速和柱長對分離效果有何影響？為什么？答：（首先應(yīng)對分子篩層析的原理進(jìn)行一定的闡述，與后續(xù)問

8、題的回答進(jìn)行因果聯(lián)系：當(dāng)待測物質(zhì)被洗脫通過凝膠柱時(shí)，分子大小不同的物質(zhì)受到不同的阻滯作用。半徑接近或超過網(wǎng)眼半徑的分子，不進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼之中。被排阻的粒子受到的阻滯作用小，在重力作用下隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿著較短流程向下流動，移動速度快而先流出層析柱；而半徑小于網(wǎng)眼半徑的分子可完全進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時(shí)要經(jīng)過逐層擴(kuò)散，阻滯作用大，流程長，移動速度慢，因而后流出層析柱。從而樣品中混合物根據(jù)分子大小的不同被分離開來。）流速過快時(shí)會使小分子物質(zhì)改變原來的洗脫途徑，大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間的速度差異不明顯，在一定時(shí)間內(nèi)，速度差異所累積的距離也并不明顯，會影響分離效果，流速過慢時(shí)大分

9、子物質(zhì)速度的優(yōu)勢也得不到體現(xiàn)，同時(shí)花費(fèi)時(shí)間很長，擴(kuò)散現(xiàn)象明顯，會影響分離效果。柱長過短時(shí)，物質(zhì)分離不充分時(shí)便被洗脫，影響分離效果，柱長過長時(shí)，擴(kuò)散現(xiàn)象明顯，操作不方便影響分離效果。8、何謂電泳現(xiàn)象？生物大分子可以利用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析、鑒定的基本理論原理。答：1）電泳現(xiàn)象，即帶電粒子在電場中能夠向與其所帶電荷相反方向的電極泳動，是自然界中普遍存在的現(xiàn)象。2）由公式v=Eq6可以看出，粒子移動的速度（v）與電場強(qiáng)度（E）和粒子所帶電荷量（q）成正比，而與粒子的大?。ǎ┖腿芤旱恼扯龋ǎ┏煞幢取４送?，非球形粒子（如線形DNA分子）在電泳過程中會受到較大的阻力，即粒子移動速度還與其形狀有關(guān)。生物大

10、分子如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在一定的pH條件下，每一個(gè)分子都會帶有特殊種類以及數(shù)量的電荷，再加上大小以及形狀的差異，這些分子在相同電場的作用下會產(chǎn)生不同的遷移速度，經(jīng)過一定的時(shí)間便會集中到特有的位置上而形成緊密的泳動帶，這便是對生物大分子進(jìn)行分離、分析、鑒定的基本理論原理。9、聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析小麥過氧化物酶同功酶試驗(yàn)中，為什么要梯度上樣？染色后電泳圖譜能反映樣品哪些信息？答：1）梯度上樣：在上樣時(shí)，采取梯度上樣策略。這是為了獲取更多、更全面的信息。在上樣量多的條帶上，我們可以發(fā)現(xiàn)蛋白含量最少，顏色最淺的條帶，在上樣量少的條帶上，我們可以明顯地看出顏色深淺的差異，

11、發(fā)現(xiàn)條帶中酶活的差別。此外，我們還可以得到針對一份樣品的最適上樣量。2）同工酶的種數(shù)：一般來講，不同的譜帶是不同的蛋白質(zhì)；各種同工酶的含量：譜帶寬的酶量含量多；酶的活性：染色的深淺可以對此進(jìn)行反應(yīng)；酶移動的速率差異：通過條帶離起點(diǎn)的位置可以看出。（含量高，酶活強(qiáng)的譜帶顏色深，可能寬些）10、中性鹽沉淀中硫銨分級沉淀是蛋白質(zhì)粗分級中最常用的手段，為什么？在進(jìn)行實(shí)際操作時(shí)要注意什么？為什么？答：1）（原理：大量中性鹽加入使水活度降低，它們在爭奪溶劑水的同時(shí)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，使疏水氨基酸暴露，從而發(fā)生聚集沉淀下來。）中性鹽硫銨分級沉淀是粗分級中較為精細(xì)的一種方法，隨著硫銨濃度的上升，能夠破壞水化層厚度增加，而不同蛋白質(zhì)分子的雙電層水膜厚度不一，所以穩(wěn)定性就有差異，因而不同濃度的硫酸銨對沉淀的目標(biāo)蛋白具有一定的選擇性；硫酸銨是中性鹽，不破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)；硫酸銨在水中的溶解度大、溫度系數(shù)小，在低溫時(shí)仍可以高濃度存在，既能夠滿足低溫沉淀某些蛋白質(zhì)的需要，又能有效爭奪溶劑水和破壞蛋白質(zhì)水化層，使蛋白質(zhì)有效沉淀；在同等濃度下，硫酸