人8版DNA的生物合成

1、目錄目錄目錄目錄第十四章第十四章dna的生物合成的生物合成dna biosynthesis ( replication )目錄目錄復(fù)制復(fù)制(replication) 是以是以dna為模板的為模板的dna合成，是基因組的復(fù)制過程。在這個過程中，合成，是基因組的復(fù)制過程。在這個過程中，親代親代dna作為合成模板，按照堿基配對原則作為合成模板，按照堿基配對原則合成子代分子，其化學(xué)本質(zhì)是酶促脫氧核苷酸合成子代分子，其化學(xué)本質(zhì)是酶促脫氧核苷酸聚合反應(yīng)。聚合反應(yīng)。 復(fù)制復(fù)制親代親代dna子代子代dna目錄目錄n本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容： dna dna復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征 dna復(fù)制的酶學(xué)和拓撲

2、學(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化 原核生物原核生物dnadna復(fù)制過程復(fù)制過程真核生物真核生物dnadna生物合成過程生物合成過程 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 dna復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征basic rules of dna replication第第 一一 節(jié)節(jié)目錄目錄半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semi-conservative replication)雙向復(fù)制雙向復(fù)制(bidirectional replication)半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) ndna復(fù)制的主要特征復(fù)制的主要特征 目錄目錄一、一、 dna以半保留

3、方式進行復(fù)制以半保留方式進行復(fù)制 dna生物合成時，母鏈生物合成時，母鏈dna解開為兩解開為兩股單鏈，各自作為模板股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的胞的dna，一股單鏈從親代完整地接受過，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的細胞的dna都和親代都和親代dna堿基序列一致。堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制半保留復(fù)制。n半保留復(fù)制半保留復(fù)制的概念的概念: :目錄目錄n子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母

4、鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度實驗密度梯度實驗: : 實驗結(jié)果支持實驗結(jié)果支持半保留復(fù)制半保留復(fù)制的設(shè)想。的設(shè)想。含含15n-dna的細菌的細菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果目錄目錄按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代dna與親代與親代dna a的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。n半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義: :遺傳的保守性，是

5、物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但但不是絕對的不是絕對的。目錄目錄aggtactgccactggtccatgacggtgaccccactggggtgaccaggtactgtccatgactccatgacaggtactgaggtactgccactggtccatgacggtgaccaggtactgccactggtccatgacggtgacc+母鏈母鏈dna復(fù)制過程中形成復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉的復(fù)制叉子代子代dna目錄目錄 原核生物基因組是環(huán)狀原核生物基因組是環(huán)狀dna，只有一個，只有一個復(fù)制起復(fù)制起點（點（origin）。復(fù)制從起點開始，向兩個方向。復(fù)制從起點開始，向兩

6、個方向進行解鏈，進行的是單點起始進行解鏈，進行的是單點起始雙向復(fù)制雙向復(fù)制。二、二、dna復(fù)制從起點向兩個方向延伸復(fù)制從起點向兩個方向延伸復(fù)制中的放射自顯影圖象復(fù)制中的放射自顯影圖象a. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈dna及復(fù)制起始點及復(fù)制起始點b. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉c. 復(fù)制接近終止點復(fù)制接近終止點(termination, ter)oritera b c目錄目錄 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個的距離定為一個復(fù)制子復(fù)制子(replicon) 。復(fù)制子

7、是。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。獨立完成復(fù)制的功能單位。 53oriorioriori5353oriorioriori535533553復(fù)制復(fù)制3目錄目錄三、三、dna復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)特征復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)特征3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)目錄目錄 順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(leading strand) 。 另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不

8、能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為鏈稱為后隨鏈后隨鏈(lagging strand) 。復(fù)制中的不連。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為續(xù)片段稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。制的半不連續(xù)性。 目錄目錄dna復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化第第 二二 節(jié)節(jié)the enzymology and topology of dna replication目錄目錄n參與參與dna復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì): 底物底物(substrate)

9、: datp, dgtp, dctp, dttp； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴dna的的dna聚合酶，聚合酶，簡寫為簡寫為 dna-pol； 模板模板(template): 解開成單鏈的解開成單鏈的dna母鏈；母鏈； 引物引物(primer): 提供提供3 -oh末端使末端使dntp可以依次可以依次聚合；聚合； 其他的其他的酶和蛋白質(zhì)因子酶和蛋白質(zhì)因子。目錄目錄(dnmp)n + dntp (dnmp)n+1 + ppirna引物引物rna引物引物子代子代dna目錄目錄n聚合反應(yīng)的特點聚合反應(yīng)的特點: : dna 新鏈生成需新鏈生成需rna引物引物和和模板模板； 新鏈的延

10、長只可沿新鏈的延長只可沿5 3 方向進行。方向進行。目錄目錄一、一、dna聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合 全稱：全稱：依賴依賴dna的的dna聚合酶聚合酶 (dna-dependent dna polymerase) 簡稱：簡稱：dna-pol 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 a g c t t c a g g a t a 3 | | | | | | | | | | |3 t c g a a g t c c t a g c g a c 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突變的能切

11、除突變的 dna片段。片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 目錄目錄（一）原核生物有（一）原核生物有3種種dna聚合酶聚合酶 dna-pol dna-pol dna-pol 目錄目錄原核生物的原核生物的dnadna聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kd)dna-pol iiidna-pol iidna-pol i可

12、能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kd)dna-pol iiidna-pol iidna-pol i目錄目錄個核心酶個核心酶1個個 -復(fù)合物（復(fù)合物（ 、 、 、 、 、 6種亞種亞基）基）1對對 -亞基（可滑動亞基（可滑動的的dna夾子）夾子）dna聚合酶聚合酶全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括：目錄目錄 亞基亞基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成dna 亞基亞基具有具有3

13、5 外切酶活性（復(fù)制保真性外切酶活性（復(fù)制保真性所必需）所必需） 亞基可增強其活性亞基可增強其活性 亞基亞基可能起組裝作用可能起組裝作用核心酶由核心酶由 、 和和 亞基組成：亞基組成：兩側(cè)的兩側(cè)的 亞基發(fā)揮夾穩(wěn)亞基發(fā)揮夾穩(wěn)dnadna模板鏈，并使酶沿模模板鏈，并使酶沿模板滑動的作用板滑動的作用目錄目錄2個個 -亞基亞基分別和分別和1個核心酶相互作用，其個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個全酶分子的個全酶分子的2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責(zé)合成個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。前導(dǎo)鏈和后隨鏈。功能：功能：有促進全酶組裝至模板上及增

14、強核心酶有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶活性的作用活性的作用 -復(fù)合物由復(fù)合物由6種亞基組成：種亞基組成： 、 、 、 、 、 目錄目錄n功能：功能： dna-pol （109kd）對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。中出現(xiàn)的空隙進行填補。目錄目錄323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸dna聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性n 端端c 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶dna-pol klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成dna，進

15、行，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 目錄目錄 dna-pol （120kd） dna-pol ii基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。 dna-pol 對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的損傷的dna模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與此認為，它參與dna損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。目錄目錄（二）常見的真核細胞（二）常見的真核細胞dna聚合酶有聚合酶有5種種dna-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活

16、性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制參與低保真度的復(fù)制 。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺口的作用?？诘淖饔谩Ｔ诰€粒體在線粒體dna復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。dna-pol dna-pol dna-pol dna-pol 目錄目錄真核生物和原核生物真核生物和原核生物dna聚合酶的比較聚合酶的比較 e.coli真核細胞真核細胞 功能功能填補復(fù)制中的填補復(fù)制中的dna空隙，空隙，dna修復(fù)和修復(fù)和重組重組復(fù)制中的校對，復(fù)制中的校對，dna修復(fù)修復(fù) dna修復(fù)修復(fù) 線粒體線粒體dna合成合成 前導(dǎo)鏈合成前導(dǎo)鏈合成dnag 引物酶引物酶 后

17、隨鏈合成后隨鏈合成目錄目錄真核生物的真核生物的dna聚合酶聚合酶填填補補引引物物空空隙隙，切切除除修修復(fù)復(fù)，重重組組延延長長子子鏈鏈的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性線線粒粒體體dna復(fù)復(fù)制制低低保保真真度度的的復(fù)復(fù)制制起起始始引引發(fā)發(fā)，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kd）dna-pol填填補補引引物物空空隙隙，切切除除修修復(fù)復(fù)，重重組組延延長長子子鏈鏈的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性線線粒粒體體dna復(fù)復(fù)制制低低保保真真度度的的復(fù)復(fù)制制起起始始

18、引引發(fā)發(fā)，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kd）dna-pol目錄目錄二、二、dna聚合酶的堿基選擇和校對功聚合酶的堿基選擇和校對功能實現(xiàn)復(fù)制的保真性能實現(xiàn)復(fù)制的保真性 復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。準確傳代的基本原理。 此外還需酶學(xué)的機制來保證復(fù)制的保真性。此外還需酶學(xué)的機制來保證復(fù)制的保真性。目錄目錄遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復(fù)制延

19、長時對堿基的選擇功能；復(fù)制出錯時有即時校對功能。復(fù)制出錯時有即時校對功能。ndna復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制：復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制：目錄目錄（一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇（一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇 利用利用“錯配錯配”實驗發(fā)現(xiàn)，實驗發(fā)現(xiàn)，dna pol dna pol 對核苷酸的對核苷酸的參入（參入（incorporationincorporation）具有選擇功能。）具有選擇功能。 dna pol dna pol 對嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親和力，對嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親和力，因此實現(xiàn)其選擇功能。因此實現(xiàn)其選擇功能。 目錄目錄（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復(fù)制

20、中辨（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認切除錯配堿基并加以校正認切除錯配堿基并加以校正目錄目錄a：dna-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。性摻入正確配對的底物。b：堿基配對正確，：堿基配對正確， dna-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。dna pol 的校讀功能的校讀功能目錄目錄三、復(fù)制中的解鏈伴有三、復(fù)制中的解鏈伴有dna 分子分子拓撲學(xué)變化拓撲學(xué)變化dna分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把dna解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。目錄目錄（一）多種酶參與（一）多種酶

21、參與dna解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)理順理順dna鏈鏈拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 (gyra, b)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈dna結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白ssb催化催化rna引物生成引物生成引物酶引物酶dnag (dnag)運送和協(xié)同運送和協(xié)同dnabdnac (dnac)解開解開dna雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶dnab (dnab)辨認起始點辨認起始點dnaa (dnaa)蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)目錄目錄e. coli 基因圖基因圖目錄目錄解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用atp供能，作用于供

22、能，作用于氫鍵，使氫鍵，使dna雙鏈解開成為兩條單鏈。雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶引物酶(primase) 復(fù)制起始時催化生成復(fù)制起始時催化生成rna引物的酶。引物的酶。單鏈單鏈dna結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(single stranded dna binding protein, ssb) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整態(tài)并保護單鏈的完整。 目錄目錄108局部解鏈后局部解鏈后（二）（二）dna拓撲異構(gòu)酶改變拓撲異構(gòu)酶改變dna超螺旋狀態(tài)超螺旋狀態(tài)n復(fù)制過程正超螺旋的形成：復(fù)制過程正超螺旋的形成：目錄目錄解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成目錄目錄

23、既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。、又能連接磷酸二酯鍵。 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶n拓撲異構(gòu)酶分類：拓撲異構(gòu)酶分類：n拓撲異構(gòu)酶作用特點：拓撲異構(gòu)酶作用特點：目錄目錄拓撲異拓撲異構(gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷dna雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使dna解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當時候封解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當時候封閉切口，閉切口，dna變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)反應(yīng)不需不需atp。拓撲異拓撲異構(gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷dna分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用利用atp供能，連接斷端，供能，連接斷端， dna分子進入負超螺旋狀態(tài)。分子進入負超螺旋狀

24、態(tài)。n作用機制：作用機制：目錄目錄n拓撲酶的作用方式：拓撲酶的作用方式：目錄目錄四、四、dna連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口單鏈缺口連接連接dna鏈鏈3 -oh末端和相鄰末端和相鄰dna鏈鏈5 -p末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的鄰的dna鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。n dna連接酶連接酶(dna ligase)作用方式：作用方式：poo-o-oho5poo-o-o335dna連接酶連接酶atpadp5353ndna連接酶的作用：連接酶的作用：目錄目錄 dna連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的連接酶在復(fù)制中起

25、最后接合缺口的作用。作用。 在在dna修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用?？谧饔谩?也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目錄目錄提供核糖提供核糖3 -oh提供提供5 -p結(jié)果結(jié)果dna聚合酶聚合酶引物或延長中的引物或延長中的新鏈新鏈游離游離dntp去去ppi(dntp)n+1連接酶連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)不連續(xù)連續(xù)鏈連續(xù)鏈拓撲酶拓撲酶切斷、整理后的兩鏈切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)改變拓撲狀態(tài)dna聚合酶，拓撲酶和連接酶催化聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3 ,5 -磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生成的

26、比較目錄目錄原核生物原核生物dna復(fù)制過程復(fù)制過程the process of dna replication in prokaryotes第第 三三 節(jié)節(jié)目錄目錄起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過程起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過程中，各種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點處裝配引中，各種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點處裝配引發(fā)體，形成復(fù)制叉并合成發(fā)體，形成復(fù)制叉并合成rnarna引物。引物。需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. dna解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供形成引發(fā)體，合成引物，提供3 -oh末端。末端。一、一、復(fù)制的起始復(fù)制的起始目錄目錄e.co

27、li復(fù)制起始點復(fù)制起始點 oric gattntttattt gatctnttntatt gatctcttattag 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 tgtggatta-ttatacaca-tttggataa-ttatccaca58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 （一）（一） dna的解鏈的解鏈目錄目錄原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈 目錄目錄目錄目錄 dna a dna b、 dna c

28、dna拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶引物引物酶酶ssb3 5 3 5 （二）引物合成和引發(fā)體形成（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、dnac蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和dna復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。目錄目錄3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈rna分子。分子。引物引物3 ho5引物引物酶酶目錄目錄引發(fā)體和復(fù)制叉的生成引發(fā)體和復(fù)制叉的生成目錄目錄目錄目錄二、二、dna鏈的延長鏈的延長復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在dna-pol催化下，催化下，dntp以以dnmp的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入

29、引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 35 5datpdgtpdttpdctpdttpdgtpdatpdctpoh 33 3dna-pol目錄目錄n領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5 5 33 方向可以連續(xù)地延長。方向可以連續(xù)地延長。n后隨鏈的合成后隨鏈的合成目錄目錄 在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈復(fù)復(fù)制制過過程程簡簡圖圖目錄目錄目錄目錄 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀dna，雙向復(fù)制的復(fù)制片段，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。處匯合

30、。oriter e.coli8232 ori tersv40500三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止目錄目錄5 5 5 rna酶酶ohp5 dna-pol dntp5 5 patp adp+pi5 5 dna連接酶連接酶n 子鏈中的子鏈中的rna引物被取代引物被取代目錄目錄目錄目錄目錄目錄真核生物真核生物dna生物合成生物合成過程過程the process of dna biosynthesis in eukaryotes第第 四四 節(jié)節(jié)目錄目錄真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進速度慢等；前進速度慢等；dna復(fù)制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生復(fù)制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)

31、生dna聚聚合酶合酶 / 轉(zhuǎn)換；轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段切除岡崎片段rna引物的是核酸酶引物的是核酸酶rnase h和和fen1等。等。 真核生物與原核生物真核生物與原核生物dna復(fù)制的差異：復(fù)制的差異：目錄目錄哺乳動物的哺乳動物的細胞周期細胞周期dna合成期合成期g1g2sm細胞能否分裂，決定于進入細胞能否分裂，決定于進入s期及期及m期這兩個關(guān)期這兩個關(guān)鍵點。鍵點。g1s及及g2m的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實施調(diào)控作用。而實施調(diào)控作用。 目錄目錄真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制

32、真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子復(fù)制。子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。激活而不是同步起動。 復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要dna-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復(fù)（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復(fù)制因子制因子(replication factor, rf)。 一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似目錄目錄酵母復(fù)制起點為酵母復(fù)制起點為自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequences，ars）：

33、酵母染色體含有多個復(fù)制起點。酵母染色體含有多個復(fù)制起點。 元件元件a(富含富含a/t的共有序列的共有序列)：結(jié)合一個特異的蛋白質(zhì)：結(jié)合一個特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物復(fù)合物復(fù)制起點識別復(fù)合物復(fù)制起點識別復(fù)合物(orc)。 3個序列個序列(b1、b2和和b3)可以增加復(fù)制起點的效率，其可以增加復(fù)制起點的效率，其中中b2的的9個堿基與上述個堿基與上述ars共有序列相同。共有序列相同。酵母復(fù)制起始點酵母復(fù)制起始點目錄目錄增殖細胞核抗原（增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，pcna）在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。用。pcna為同源三聚體

34、，具有與為同源三聚體，具有與e.coli dna 聚聚合酶合酶的的亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形成閉合環(huán)形的可滑動成閉合環(huán)形的可滑動dna夾子，在夾子，在rfc的作用下的作用下pcna結(jié)合于引物模板鏈；并且結(jié)合于引物模板鏈；并且pcna使使pol獲得持續(xù)合成能力。獲得持續(xù)合成能力。pcna水平也是檢驗細胞增水平也是檢驗細胞增殖的重要指標。殖的重要指標。目錄目錄拓撲異構(gòu)酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正拓撲異構(gòu)酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋超螺旋tol和和toldna雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體雙螺旋解

35、鏈，參與組裝引發(fā)體dna解旋酶解旋酶連接岡崎片段連接岡崎片段dna連接酶連接酶核酸酶，切除核酸酶，切除rna引物引物rnase h核酸酶，切除核酸酶，切除rna引物引物fen1dna復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)pol / 合成合成rna-dna引物引物pol /引發(fā)酶引發(fā)酶有依賴有依賴dna的的atpase活性，結(jié)合于引物活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活模板鏈，激活dna聚合酶，聚合酶， 促使促使pcna結(jié)合于引物結(jié)合于引物-模板鏈模板鏈rfc激活激活dna聚合酶和聚合酶和rfc的的atpase活性活性pcna單鏈單鏈dna結(jié)合蛋白，激活結(jié)合蛋白，激活dn

36、a聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合dnarpa功功 能能蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)真核真核dna復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能目錄目錄 dna-pol 和和pol 分別兼有解螺旋酶和引物酶活分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，性。在復(fù)制叉及引物生成后，dna-pol 通過通過pcna的協(xié)同作用，逐步取代的協(xié)同作用，逐步取代pol ，在，在rna引物引物的的3 -oh基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由pcna協(xié)同，協(xié)同，pol 置換置換pol ，繼續(xù)合成，繼續(xù)合成dna子鏈。子鏈。 二、

37、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生二、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生dna聚合酶聚合酶/轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換目錄目錄 前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期 后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際 發(fā)生發(fā)生dna聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換的原因是轉(zhuǎn)換的原因是pol 不具備不具備持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力。 dna聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是關(guān)鍵蛋白是rfc。dna聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換目錄目錄真核真核dna聚聚合酶轉(zhuǎn)換和合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成后隨鏈合成目錄目錄3 5 5 3 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈3 5 3 5 親代親代dna后隨鏈后隨鏈引物引物核小體核小體三、真核生物三、真核生物dna合成

38、后立即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體目錄目錄染色體染色體dna呈線狀，復(fù)制在末端停止。呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端染色體兩端dna子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的rna引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題目錄目錄n切除引物的兩種機制切除引物的兩種機制目錄目錄前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈產(chǎn)生產(chǎn)生完整完整的子染色單體。的子染色單體。后隨鏈后隨鏈3 3 端留下端留下縮短的縮短的未復(fù)制的未復(fù)制的ssdna區(qū)區(qū)。5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3

39、 3 3 3 5 5 目錄目錄端粒（端粒（telomeres）由富含由富含tg的重復(fù)序列組成。的重復(fù)序列組成。人的端粒重復(fù)序列為人的端粒重復(fù)序列為5-(tngn)x-3 。這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個染色體的這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個染色體的3端比端比5 端長，形成單鏈端長，形成單鏈ssdna。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決染色體末端復(fù)制問題。染色體末端復(fù)制問題。目錄目錄端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶rna (human telomerase rna, htr)端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1,

40、 htp1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, htrt) n組成：組成：目錄目錄端粒酶（端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（是一種核糖核蛋白（rnp），），由由rna和蛋白質(zhì)組成。和蛋白質(zhì)組成。端粒酶以自己的端粒酶以自己的rna組分作為模板，以染色體的組分作為模板，以染色體的3 端端ssdna（后隨鏈模板）（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加為引物，將端粒序列添加于染色體的于染色體的3 端。這些新合成的端。這些新合成的dna為單鏈為單鏈。目錄目錄n端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 目錄目錄真

41、核所有染色體真核所有染色體dna復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細胞復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細胞周期的周期的s期期，而且只能復(fù)制一次。，而且只能復(fù)制一次。五、真核生物染色體五、真核生物染色體dna在每個細胞周在每個細胞周期中只能復(fù)制一次期中只能復(fù)制一次目錄目錄前復(fù)制復(fù)合物在前復(fù)制復(fù)合物在g1期形成而在期形成而在s期被激活期被激活真核細胞真核細胞dna復(fù)制的起始分兩步進行，即復(fù)制的起始分兩步進行，即復(fù)復(fù)制基因的選擇制基因的選擇和和復(fù)制起點的激活。復(fù)制起點的激活。復(fù)制基因（復(fù)制基因（replicator）是指是指dna復(fù)制起始復(fù)制起始所所必需的必需的全部全部dna序列序列。目錄目錄 復(fù)制基因的選擇復(fù)制基因的選擇出現(xiàn)于出現(xiàn)于g

42、1期期，基因組的每個復(fù)，基因組的每個復(fù)制基因位點均組裝制基因位點均組裝前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-replicative complex，pre-rc）。 復(fù)制起點的激活復(fù)制起點的激活出現(xiàn)于細胞進入出現(xiàn)于細胞進入s期期以后，這一以后，這一階段將階段將激活激活pre-rc，募集若干復(fù)制基因結(jié)合蛋，募集若干復(fù)制基因結(jié)合蛋白和白和dna聚合酶，并起始聚合酶，并起始dna解旋。解旋。在原核細胞中，復(fù)制基因的識別與在原核細胞中，復(fù)制基因的識別與dna解解旋、募集旋、募集dna聚合酶偶聯(lián)進行。而在真核細胞聚合酶偶聯(lián)進行。而在真核細胞中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在中，這兩個階段相分離可以確

43、保每個染色體在每個細胞周期中僅復(fù)制一次。每個細胞周期中僅復(fù)制一次。目錄目錄orc至少募集兩種解旋酶加載至少募集兩種解旋酶加載蛋白蛋白cdc6和和cdt1。復(fù)制起點識別復(fù)合物（復(fù)制起點識別復(fù)合物（originrecognition complex，orc）識別并結(jié)合復(fù)制基因。識別并結(jié)合復(fù)制基因。三種蛋白質(zhì)一起募集真核細胞三種蛋白質(zhì)一起募集真核細胞解旋酶解旋酶mcm2-7。前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-rc）的形成）的形成目錄目錄pre-rc磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點組裝其它復(fù)制因子磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點組裝其它復(fù)制因子并起始復(fù)制，復(fù)制因子包括并起始復(fù)制，復(fù)制因子包括3種種dna聚合酶。聚合酶。dn

44、a聚合酶在復(fù)制起點按一定順序組裝：首先聚合酶在復(fù)制起點按一定順序組裝：首先pol 和和pol 結(jié)合，然后是結(jié)合，然后是pol /引發(fā)酶。引發(fā)酶。在在s期期，pre-rc被蛋白激酶（被蛋白激酶（ddk和和cdk）磷）磷酸化，從而被激活。酸化，從而被激活。目錄目錄pre-rc的激活的激活和組裝真核和組裝真核dna復(fù)制叉復(fù)制叉目錄目錄（1）激活）激活pre-rc，以起始，以起始dna復(fù)制；復(fù)制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-rc。cdk控制控制pre-rc的形成和激活的形成和激活真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cyclin-dependent

45、 kinases，cdk）嚴格控制）嚴格控制pre-rc的形成和激活。的形成和激活。cdk功能：功能：目錄目錄在每個細胞周期過程中，僅有一次機會形成在每個細胞周期過程中，僅有一次機會形成pre-rc，也僅有一次機會激活，也僅有一次機會激活pre-rc。pre-rc在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基因可形成新的因可形成新的pre-rc并迅速結(jié)合并迅速結(jié)合orc。但在。但在s、g2和和m期，高活性的期，高活性的cdk抑制抑制pre-rc的其它組分的其它組分結(jié)合結(jié)合orc。只有當染色體分離和細胞分裂完成時，。只有當染色體分離和細胞分裂完成時，cdk的活性消失，新的的活性消失，新的pre-rc才能形成。才能形成。目錄目錄逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式reverse transcription & other dna replication ways第五節(jié)第五節(jié)目錄目錄 雙鏈雙鏈dna是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些病毒的遺傳物質(zhì)是病毒的遺傳物質(zhì)是rna。原核生物