大鼠鐵蛋白FE酶聯(lián)免疫分析ELISA

1、大鼠鐵蛋白(FE)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定熱大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中鐵蛋白(FE的含量實驗原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠鐵蛋白(FE)水平。用純化的大鼠鐵蛋白(FE)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入鐵蛋白(FE)，再與HRP標(biāo)記的鐵蛋白(FE)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深 淺和樣品中的鐵蛋白(FE)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度(0D值)，通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線計

2、算樣品中大鼠鐵蛋白(FE)濃度。試劑盒組成試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份圭寸板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1個1個酶標(biāo)包被板1X 481X 962-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品：2700ng/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶標(biāo)試劑3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存終止液3m

3、l X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml X 30 倍)X 1 瓶2-8 C保存樣本處理及要求：1血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)份)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次 離心。3. 尿液：用無菌管收集，離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)份)。仔細(xì)收集上清，保存過程 中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸

4、腹水、腦脊液參照實行。4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8C的溫度。加入一定量的PBS （ PH7.4）,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右

5、（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待 檢測，其余冷凍備用。6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上 進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于 -20 C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 .7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 M，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 d分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d,混勻；然后在第三孔和第四孔中先各

6、取50dl 棄掉，再各取 50dl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 d分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻后從第七、第八孔中分別取 50dl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn) 品稀釋液50 d，混勻后從第九第十孔中各取50 d棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50 d,濃度分別為 1800ng/L， 1200ng/L ， 600ng/L ， 300ng/L ，1 50ng/L ）。2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包

7、被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 d,然后再加待測樣品10 d （樣品最終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置37 C溫育30分鐘。4. 配液：將30 （48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （48T的20倍）倍稀釋后備用。5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 dl ，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50 d，再加入顯色劑 B50 d，輕輕震蕩混勻，37 C避光

8、顯色15分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50 d，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零， 450nm 波長依序測量各孔的吸光度（ OD 值）。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。注意事項：1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測

9、物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX 5）O5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6.底物請避光保存。7 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).&所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9. 本試劑不同批號組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式， 將樣品的 OD 值代入方