辛伐他汀對脂多糖誘導(dǎo)的細胞黏液高分泌的抑制

1、辛伐他汀對脂多糖誘導(dǎo)的細胞黏液高分泌的抑制         10-09-08 10:01:00     編輯：studa20                   作者：楊捷 馮玉麟 耿艷鳴 喬云飛 【摘要】  目的 觀察具有抗炎活性的辛伐他汀對脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞A549

2、黏蛋白表達的影響并探討其機制。方法 用不同濃度的辛伐他汀作用于培養(yǎng)的A549細胞，采用定量RTPCR、ELISA和明膠酶譜法分別檢測細胞的黏蛋白MUC5AC mRNA表達水平、MUC5AC蛋白含量及細胞上清基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)9活性。結(jié)果 辛伐他汀組細胞中MUC5AC蛋白含量及MUC5AC mRNA水平較脂多糖組均明顯下降(P<0.05)， 且濃度越高，作用越強。在正常情況下A549細胞培養(yǎng)上清液中幾乎檢測不到MMP9活性，而LPS作用后上清中MMP9活性明顯增強(P<0.01)，預(yù)先給予不同濃度辛伐他汀孵育細胞培養(yǎng)上清液MMP9活性顯著下降(P<0.05)。結(jié)論 LP

3、S誘導(dǎo)的A549細胞黏蛋白MUC5AC在mRNA和蛋白水平的升高與MMP9活性增強有關(guān),而辛伐他汀可減少LPS誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白表達，且呈濃度依賴性,提示其作用可能與抑制MMP9活性有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  辛伐他汀;脂多糖;黏蛋白;肺泡上皮細胞黏液高分泌是包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等在內(nèi)的慢性氣道炎癥性疾病重要病理生理特征。過度分泌的黏液因其可加重氣流阻塞并作為細菌定植和生長的培養(yǎng)基，導(dǎo)致抗生素效能下降，而成為影響疾病死亡率的一項獨立危險因素1。細菌感染可促進黏液高分泌，即臨床所說的痰液增多，甚至痰栓形成，其中革蘭陰性桿菌的重要毒力因子脂多糖(LPS)是強效

4、促黏液分泌劑。在本研究中，體外黏液高分泌模型的建立是通過LPS刺激具有表達黏蛋白能力的肺泡上皮細胞A549。氣道黏液的黏彈性主要取決于由黏膜下腺體的黏液腺細胞和氣道上皮的杯狀細胞合成的高度糖苷化蛋白質(zhì)的黏蛋白(MUC)?，F(xiàn)已證實MUC5AC是慢性炎癥時呼吸道黏液所呈現(xiàn)的主要MUC表型2。研究表明，他汀類降脂藥具有抗炎作用，并對病毒性肝炎、腎炎等疾病具有治療作用。本研究通過LPS誘導(dǎo)A549細胞建立體外黏液分泌模型，旨在初步探索辛伐他汀對氣道黏液分泌的影響及機制。1 材料與方法1.1 材料 肺泡上皮細胞株A549由本實驗室保存。辛伐他汀購自杭州默沙東制藥公司;LPS、明膠、噻唑藍 (MTT)、T

5、ripure購自美國Sigma公司;胰蛋白、RPMI1640購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;小鼠MUC5AC單克隆抗體購自Chemicon公司;基質(zhì)金屬蛋白酶明膠酶譜法電泳分析試劑盒為上海GeneMed Scientifics公司產(chǎn)品;TaqDNA聚合酶為美國Promega公司產(chǎn)品;PCR試劑盒為大連寶生物工程公司產(chǎn)品;cDNA第一條鏈合成試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1.2 細胞培養(yǎng) A549細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活的胎牛血清，并加入1%L谷氨酰胺及1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于37、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育;當細胞融合達70%9

6、0%時，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。1.3 藥物處理3 辛伐他汀按16 mg/ml溶于0.06 mol/L NaOH和40%乙醇，于50加熱2 h，用HCl調(diào)整溶液pH至7.2，加入等體積的蒸餾水，使其濃度為40 mol/L，凍存于-20備用。采用MTT比色法檢測實驗濃度辛伐他汀對細胞活力影響，酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長測定各孔吸光度值(A)。計算細胞活力：細胞存活率=實驗組A值/陰性對照組A值×100%，每實驗組設(shè)8個復(fù)孔，取均值。1.4 分組 細胞隨機分為對照組 (無血清培養(yǎng)基培養(yǎng))、LPS組(無血清培養(yǎng)基中加入10 g/ml LPS)、辛伐他汀組 (無血清培養(yǎng)基中加

7、入30 mol/L辛伐他汀)、LPS+20 mol/L辛伐他汀組 (先于無血清培養(yǎng)基中加入20 mol/L辛伐他汀孵育30 min后，再給予同樣濃度LPS)、LPS+30 mol/L辛伐他汀組 (先于無血清培養(yǎng)基中加入30 mol/L辛伐他汀孵育30 min后，再給予同濃度LPS)，各組均培養(yǎng)24 h后行指標檢測。1.5 熒光定量RTPCR檢測細胞MUC5AC mRNA表達 提取細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行定量PCR。引物由上海Genebase生物公司合成。MUC5AC上游引物序列為5TCCTTCTTGTCAATGGTGTCT3;下游為5ACCAGGTTCAGGACAAGTAG3;G

8、APDH上游引物序列為5CCTCAAGATTGTCAGCAAT3;下游為5CCATCCACAGTCTTCTGAGT3。根據(jù)目的基因MUC5AC與管家基因GAPDH的標準曲線，將提取的RNA樣品進行定量，PCR反應(yīng)條件是預(yù)變性：94×2 min;再94 25 s，50 30 s，72 40 s共40個循環(huán);最后72 延伸5 min。將檢測熒光強度的時相設(shè)定在擴增反應(yīng)的退火期 (50 30 s)，讀取樣品擴增達到所設(shè)閾值的反應(yīng)循環(huán)數(shù)Ct值，Ct=Ct(目的基因待測樣品GADPH待測樣品)Ct(校正樣品GADPH校正樣品)，計算得到MUC5AC相對于GAPDH的定量。1.6 ELISA法檢

9、測細胞裂解上清液中MUC5AC蛋白含量 提取細胞內(nèi)蛋白，行總蛋白定量，取各組樣本測定總蛋白量后用裂解液調(diào)整蛋白濃度使各樣本一致，并用0.01% PBS稀釋蛋白樣本。采用ELISA方法測定MUC5AC蛋白含量。1.7 明膠酶譜法檢測細胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)活性 收集各組細胞上清液，于4，2 000 r/min，離心5 min去細胞碎片，將上清置于70凍存?zhèn)溆?。吸?0 l條件培養(yǎng)液于1.5 ml EP管，加入上樣液，混勻，室溫下靜置10 min;取20 l樣品于含明膠的10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳12 h，置已完成的凝膠于10 ml 2.5% TritonX100溶液中浸泡低

10、速振搖1 h，于明膠酶緩沖液中37孵育1824 h，用0.5%考馬斯亮藍染色，加入10%乙酸、40%甲醇混勻，脫色至白色條帶與藍色背景對比清晰即可。凝膠掃描、照相、使用Scion Image 4.0.2圖像分析軟件測定白色條帶的光密度值(OD)，計算各組MMP9相對活性。1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以x±s表示，使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 10.0進行數(shù)據(jù)分析，兩兩比較采用方差分析。2 結(jié) 果2.1 辛伐他汀對A549細胞MUC5AC mRNA表達的影響 兩種實驗濃度的辛伐他汀對細胞活力影響小，電鏡下觀察細胞無明顯改變，細胞貼壁能力好。無LPS刺激時A549細胞即有MUC5AC mRNA

11、的表達，而LPS刺激后細胞中MUC5AC mRNA的表達明顯增加(P<0.01);在20和30 mol/L兩種濃度辛伐他汀干預(yù)下，可使MUC5AC mRNA的表達明顯降低(P<0.05)，且兩組MUC5AC mRNA表達也存在顯著性差異(P<0.05)，見表1。2.2 辛伐他汀對A549細胞MUC5AC蛋白表達的影響 LPS刺激后，細胞MUC5AC蛋白相對含量 (以MUC5AC/總蛋白表示) 較對照組明顯升高(P<0.01);預(yù)先給予兩種濃度辛伐他汀處理后再予LPS刺激，MUC5AC蛋白水平顯著下降(P<0.05)，不同濃度辛伐他汀干預(yù)作用有差異(P<0.05)，見表1。2.3 辛伐他汀對A549細胞MMP9活性的影響 凝膠中的明膠能被MMP9分解，因此在考馬斯亮藍染色后，在藍色背景下于92 kD分子量處出現(xiàn)白色負染色條帶。正常情況下A549細胞在沒有外界刺激下幾乎不表達MMP9活性。LPS刺激后細胞上清液中MMP9活性明顯增加(P<0.01);預(yù)先給予兩種濃度辛伐他汀