神經(jīng)生長因子誘導神經(jīng)母細胞瘤分化的研究

1、神經(jīng)生長因子誘導神經(jīng)母細胞瘤分化的研究         08-08-16 17:03:00     作者：魏芬生    編輯：studa20【摘要】  目的 觀察神經(jīng)生長因子（NGF）對神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)細胞增殖的抑制和可能的分子機制及NGF-TrkA信號傳導途徑在NB細胞分化中的作用。方法 取本院住院患兒新鮮手術標本，進行原代細胞培養(yǎng)作為細胞模型，通過臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞；觀察NGF干預前后細

2、胞形態(tài)學變化；MTT法檢測細胞的增值活性；RT-PCR分析TrkA表達情況。結果 NGF作用NB細胞后，細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，并可劑量依賴性的抑制細胞增殖，2d時TrkA表達增加，4d以后出現(xiàn)TrkA表達的明顯增加。結論 NGF對NB細胞體外增殖有抑制作用并誘導其分化，且表現(xiàn)劑量依賴關系；NGF可誘導NB細胞分化成熟及TrkAmRNA表達水平增高，可能是NGF誘導NB細胞分化逆轉(zhuǎn)的分子生物學機制之一。 【關鍵詞】  神經(jīng)母細胞瘤 神經(jīng)生長因子 細胞分化【Abstract】 Objective  To investigate the differentiation and p

3、roliferation of neuroblastoma(NB) cells induced by nerve growth factor(NGF) and its possible mechanisms. Methods  NB tumor tissues were collected and primary cell culture was performed. Trypan blue exclusion was used to count the alive cells. Morphological changes were observed under the phase-

4、contrast microscope. The change of cell proliferation was determined by means of MTT assay. TrkA expression was examined by RT-PCR method. Results  By day 2, the alive cells of group A、B and C decreased by treatment of NGF; morphological changes of NB cells were also observed. RT-PCR detection

5、showed that the TrkAmRNA expression increased from day 2 and reached its peak on day 8 in a time and dose dependent manner by treatment of NGF. Conclusion  NB cells treated by NGF differentiate to neuron-like cells and the cell growth is inhibited in a dose-dependent manner. TrkA's expressi

6、on is increased by NGF. This may be one of the mechanisms of spontaneous regression of NB.【Key words】  neuroblastoma  nerve growth factor  cell differentiation   神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于胚胎期神經(jīng)嵴細胞的兒童惡性腫瘤，自然退化常見于新生兒、嬰兒和早期腫瘤，而較大兒童晚期患者惡性程度高，預后差。對化療耐藥是治療失敗的主要原因1。如何應用人為方法使

7、NB細胞分化、逆轉(zhuǎn)、消退，是當今腫瘤界研究的熱點問題2，用藥物誘導NB向良性轉(zhuǎn)化可能成為臨床治療的一個新途徑。1  資料與方法1.1  一般資料 5歲男性患兒，因發(fā)現(xiàn)“腹部腫物”1周，于2004年6月10日入住本院，行腹部B超、CT檢查，考慮為神經(jīng)源性腫瘤；于2004年6月12日行剖腹探查、腹部腫物切除術。手術標本冰凍切片提示神經(jīng)母細胞瘤。為Evans分期期，無遠處轉(zhuǎn)移，術后病理診斷：神經(jīng)母細胞瘤。1.2  研究方法 (1)試劑：NGF購自晶美公司；MTT購自華美公司。其它均為國產(chǎn)分析純試劑。Trizol購自美國GBICO公司；RT-PCR試劑

8、盒購自Promega公司；TaqDNA合成酶、瓊脂粉購自上海生工生物工程公司；DNAMarker購自寶生物工程大連公司；引物TrkA引物序列根據(jù)Genebank資料設計如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，擴增產(chǎn)物為528bp，TrkA引物及-actin(114bp)內(nèi)參照引物由北京賽百盛公司合成。(2)NB細胞培養(yǎng)：用消化法進行原代細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素0.1mg/ml，在5%CO2、95%空氣環(huán)境中恒溫恒濕孵育。(3)實驗分組：用作生長及分化研究的NB細胞

9、分成4組。A組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為5mol/L；B組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為10mol/L；C組：DMEM培養(yǎng)基加入NGF使終濃度為20mol/L；D組：作為對照組，培養(yǎng)基中不加NGF干預。每組設4份同樣的標本。(4)活細胞計數(shù)：取指數(shù)生長期細胞，接種至24孔培養(yǎng)板,細胞濃度為1×105細胞/ml，于0、2、4、6、8d用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞。(5)細胞形態(tài)學觀察：用作分化研究的細胞，以1×103/ml密度接種至25ml培養(yǎng)瓶中，A、B、C、D組同時接種，于0、2、4、6、8d在相差顯微鏡下計數(shù)分化細胞。方法：對每瓶細胞選取5個不同視野的200

10、個細胞，根據(jù)Sandquist法，有一個或一個以上的軸突長度延伸至胞體直徑二倍以上者為細胞分化，計算細胞分化百分率。(6)MTT法檢測NB細胞增殖活性原理：活細胞，特別是增殖的細胞中，其中線粒體能量代謝中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍紫色的結晶沉積在細胞內(nèi)和細胞周圍，形成的結晶與細胞數(shù)成正比，用酸化異丙醇溶解結晶即可在酶標比色計上直接比色，此數(shù)值的升高標志細胞能量代謝旺盛、增殖活躍。檢測方法：細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，37、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞貼壁，按A、B、C、D組要求加入NGF，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一次；每

11、孔加濃度5mg/ml的MTT染液20l(溶于PBS中，濾過除菌，4避光保存)于37、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育細胞46 h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT 150l/孔，水平搖床上搖10min，使還原產(chǎn)物充分溶解，酶標儀上570 nm波長下測定光密度值。(7)TrkA表達檢測：NB細胞總RNA的提?。簩⑴囵B(yǎng)的細胞用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測吸光度OD260值和OD280值，計算提取物濃度及純度。經(jīng)定量后用DEPC水稀釋至1mg/ml，-20保存。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。PCR擴增反應體系：反應體系為25l，PCR反應參數(shù)：94預變性5min，變性1min，55退火45s，72延伸2min