2014微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)

1、微生物限度檢查檢驗(yàn)任務(wù):金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門(mén)菌的檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉藥品中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)原理。 2.熟悉檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)氏菌的程序與方法。二、實(shí)驗(yàn)材料1、培養(yǎng)基和稀釋液：亞碲酸鈉肉湯（或亞碲酸鈉北沙參胨水培養(yǎng)基）、卵黃高鹽瓊脂（或血平板或TMP高鹽瓊脂）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵管、膽鹽乳糖增菌液、十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基、綠膿色素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂）、硝酸鹽胨水平板（DHL）、明膠液化培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、四六磺酸鈉綠亮培養(yǎng)基（TYB増菌液）、膽鹽硫乳瓊脂、沙門(mén)、志賀菌屬培養(yǎng)基（SS）、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）、

2、麥康凱瓊脂（MacC）、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)（TSI培養(yǎng)基）、脲瓊脂培養(yǎng)基、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液-蛋白胨緩沖液。2、器皿滅菌錐形瓶（50ml）、滅菌培養(yǎng)皿、刻度吸管試劑（已配好）：1%二甲基對(duì)苯二胺鹽試液、氯仿、IN鹽酸、NS第一次 培養(yǎng)基的配制1.培養(yǎng)基及稀釋液：0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液-蛋白胨緩沖液配方：氯化鈉4.3g 蛋白胨1.0g 磷酸二氫鉀3.5g 磷酸氫二鉀7.23g 水1000ml亞碲酸鈉肉湯：90ml/瓶*3瓶卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基（或TMB培養(yǎng)基或血瓊脂平板）：3個(gè)*20ml/個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面：3個(gè)平皿*約20ml/個(gè)甘露醇發(fā)酵管：3支*5ml/支TYB増菌液：90

3、ml/瓶*3膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（或沙門(mén)氏、志賀菌屬瓊脂）：20ml/個(gè)*3個(gè)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基）：20ml/個(gè)*3三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基：5ml/支*3支脲瓊脂培養(yǎng)基斜面：5ml/支*3支半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：5ml/支*3支膽鹽乳糖增菌液（BL増菌液）：90ml/瓶*3瓶十六烷三甲基溴化銨平板：6個(gè)*20ml/個(gè)PDP瓊脂斜面：3支*5ml/支硝酸鹽胨水培養(yǎng)基：3支*5ml/支明膠培養(yǎng)基：5ml/支*3支第二次 供試液及増菌液的制備供試液的制備取供試液10ml，加入Ph7.0無(wú)菌氯化鈉溶液-蛋白胨緩沖液90ml，混勻，制成1：10供試液。稀釋傾注培養(yǎng)基將供試液傾注入已加稀

4、釋液的無(wú)菌平板，每個(gè)稀釋度注2個(gè)平皿，每個(gè)平皿約15-20ml，將供試液和培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。取亞碲酸鈉肉湯（或亞碲酸鈉北沙參胨水培養(yǎng)基）3份，每份100ml，分別加入10ml供試液，10ml供試液及0.2ml對(duì)照菌液做陽(yáng)性對(duì)照，與加入供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。置于37環(huán)境下培養(yǎng)24-48h。取四六磺酸鈉綠亮培養(yǎng)基（TYB増菌液）3份，每份100ml，分別加入10ml供試液，10ml供試液及0.2ml對(duì)照菌液做陽(yáng)性對(duì)照，與加入供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。置于 環(huán)境下培養(yǎng) 取膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（或沙門(mén)氏、志賀菌屬瓊脂）3份，每份100ml，分別加入10ml供試液，10ml供試液及0.2

5、ml對(duì)照菌液做陽(yáng)性對(duì)照，與加入供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。置于37環(huán)境下培養(yǎng)18-24h第三次 分離培養(yǎng)將上述各種供試品培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液劃線至下類各種培養(yǎng)基培養(yǎng)基種類細(xì)菌種類卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基（或TMB培養(yǎng)基或血瓊脂平板）金黃色葡萄球菌十六烷三甲基溴化銨平板綠膿桿菌膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（或沙門(mén)氏、志賀菌屬瓊脂）沙門(mén)氏菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基）沙門(mén)氏菌置于37，培養(yǎng)1824h第四次 金黃色葡萄球菌：取金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物，接種于甘露醇發(fā)酵管中，置于37C培養(yǎng)1824h?！窘瘘S色葡萄球菌發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變成黃色（溴麝香草酚藍(lán)在酸性條件下呈黃色）】。

6、綠膿桿菌：綠膿色素試驗(yàn)與硝酸鹽還原試驗(yàn)挑取分離的純培養(yǎng)物分別接種于PDP瓊脂斜面，硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)24h。明膠液化試驗(yàn)用接種針取疑似綠膿桿菌菌落，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37培養(yǎng)24h。42生長(zhǎng)試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)物，接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置42水浴中培養(yǎng)2448h，沙門(mén)氏菌：脲酶試驗(yàn)：取菌種接種于脲瓊脂培養(yǎng)基斜面，置于37培養(yǎng)1824h 動(dòng)力試驗(yàn)：穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于37培養(yǎng)1824h第五次 生化實(shí)驗(yàn)和鏡檢、表格填寫(xiě)1.生化實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌：（1）.甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)若發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變成黃色（溴麝香草酚藍(lán)在酸性條件下呈黃色）。則證明有金黃色葡萄球菌（2）

7、.血漿凝固酶試驗(yàn).玻片法 取一潔凈干燥的載玻片在兩邊分別滴加NS和血漿各一滴，用接種環(huán)取待檢菌分別在NS和血漿滴中充分研磨混合，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。凡在5min內(nèi)混箘的血漿出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性。而混菌的生理鹽水仍呈均勻渾濁狀。若混菌后的血漿和生理鹽水仍都呈均勻渾濁狀者，其結(jié)果為陰性。.試管法取無(wú)菌小試管2支，用無(wú)菌吸管吸取血漿原液或1：1鹽水血漿稀釋液加入試管中，每管各0.5ml，然后用無(wú)菌吸管吸取待檢肉湯培養(yǎng)物0.5ml,然后用無(wú)菌吸管吸取待檢肉湯培養(yǎng)基0.5ml，或用接種環(huán)直接取斜面培養(yǎng)基上的菌苔，與其中一支血漿試管中的血漿充分混和，另一支試管不加菌作對(duì)照。將2支小試管同時(shí)

8、放在37C溫箱內(nèi)保溫3h后開(kāi)始檢查，若加菌的血漿試管中24h內(nèi)出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，不加菌的血漿試管血漿仍呈液體狀，為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，若兩者均無(wú)凝固現(xiàn)象，則為陰性。綠膿桿菌：（1）氧化酶試驗(yàn)具有氧化酶的細(xì)菌能將二甲基對(duì)苯二胺氧化，使試劑中的氫脫出與氧結(jié)合，試劑則被氧化成紅色的醌類化合物。取一小塊白色潔凈的濾紙片放在平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒挑取疑似綠膿桿菌菌落涂在濾紙片上，再滴加新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽試液一滴。在30s之內(nèi)，紙片上的待檢物如出現(xiàn)粉紅色，并逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。如待檢物不變色，則為陰性。注意事項(xiàng)：鐵等金屬能催化二甲基對(duì)苯二胺液呈紅色，故不宜用接種環(huán)取菌苔，可用玻璃棒

9、或干凈火柴桿取菌； 在濾紙上滴加試劑以剛濕潤(rùn)為宜，如太濕則阻礙空氣與菌苔接觸，使呈色時(shí)間延長(zhǎng)，造成假陰性； 二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽試液容易氧化，應(yīng)裝在棕色瓶中，置冰箱保存，如變紅色則不宜使用。（2）綠膿色素試驗(yàn)在試管內(nèi)加氯仿3-5ml，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖，將瓊脂斜面培養(yǎng)物產(chǎn)生的色素提取在氯仿中。待氯仿提取液呈藍(lán)綠色時(shí)，用滴管將其移至另一試管中，然后加入1ml1mol/L鹽酸溶液，振搖后靜置片刻，如在上層的鹽酸溶液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為陽(yáng)性，證明被檢菌的培養(yǎng)物中有綠膿色素。（3）硝酸鹽還原試驗(yàn)觀察反應(yīng)結(jié)果，如該菌還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)猓囵B(yǎng)液中的杜氏小倒管內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)氣泡，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)

10、性。（4）明膠液化試驗(yàn)如穿刺局部呈液化狀態(tài)，取出放冰箱內(nèi)冷藏1030min，仍呈溶液狀，則明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性。（5）42生長(zhǎng)試驗(yàn)觀察生長(zhǎng)狀況，有菌苔生長(zhǎng)者為陽(yáng)性。沙門(mén)氏菌：靛基質(zhì)試驗(yàn)：脲酶試驗(yàn)：觀察現(xiàn)象，加入酚紅指示劑后呈紅色為陽(yáng)性氰化鉀試驗(yàn)：賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)：紫色或紫紅色：陽(yáng)性，黃色：陰性動(dòng)力試驗(yàn)：有鞭毛能運(yùn)動(dòng)：有沙門(mén)菌血清凝集試驗(yàn)：用可疑菌作為抗原，沙門(mén)菌AF“O”多價(jià)血清作為抗體進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，并以生理鹽水做對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)檢測(cè)出凝集現(xiàn)象表明可能是沙門(mén)氏菌，若凝集試驗(yàn)為陰性，則可將菌液于100水浴保溫30min后再做凝集試驗(yàn)2.鏡檢取純培養(yǎng)物，涂片，革蘭色染色，顯微鏡油鏡下觀察結(jié)晶紫（1min）-碘液（1min）-酒精（30min）-復(fù)紅3.表格填寫(xiě) 藥品微生物限度檢查試驗(yàn)記錄檢品編號(hào)： 室溫： 濕度：檢品名稱 規(guī)格批號(hào)包裝效期生產(chǎn)單位檢品數(shù)量供樣單位収驗(yàn)日期檢驗(yàn)?zāi)康臋z驗(yàn)日期檢驗(yàn)依據(jù)報(bào)告日期供試液制備：1.常規(guī)法 供試品 g（ml）Ph7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白