膨脹床吸附技術(shù)

1、膨脹床吸附技術(shù)膨脹床吸附技術(shù)膨脹床吸附膨脹床吸附1.膨脹床與傳統(tǒng)固定床的區(qū)別膨脹床與傳統(tǒng)固定床的區(qū)別2.膨脹床與流化床的區(qū)別膨脹床與流化床的區(qū)別膨脹床與傳統(tǒng)固定床的區(qū)別在于：膨脹床與傳統(tǒng)固定床的區(qū)別在于：膨脹床的床層上部安裝有可調(diào)節(jié)床層高度的膨脹床的床層上部安裝有可調(diào)節(jié)床層高度的調(diào)節(jié)器，當(dāng)液體調(diào)節(jié)器，當(dāng)液體(料液或清洗液等料液或清洗液等)從床底以高從床底以高于吸附劑最小流化速度的流速輸人時(shí)，吸附于吸附劑最小流化速度的流速輸人時(shí)，吸附劑床層產(chǎn)生膨脹，高度調(diào)節(jié)器上升，膨脹床劑床層產(chǎn)生膨脹，高度調(diào)節(jié)器上升，膨脹床狀態(tài)下床層高度一般為固定床狀態(tài)的狀態(tài)下床層高度一般為固定床狀態(tài)的23倍，倍，床層空隙率高

2、，允許茵體細(xì)胞或細(xì)胞碎片自床層空隙率高，允許茵體細(xì)胞或細(xì)胞碎片自由通過(guò)。因此，膨脹床吸附操作可直接處理由通過(guò)。因此，膨脹床吸附操作可直接處理菌體發(fā)酵液或細(xì)胞勻漿液，回收其中的目標(biāo)菌體發(fā)酵液或細(xì)胞勻漿液，回收其中的目標(biāo)產(chǎn)物，從而可節(jié)省離心或過(guò)濾竿預(yù)處理過(guò)程，產(chǎn)物，從而可節(jié)省離心或過(guò)濾竿預(yù)處理過(guò)程，提高目標(biāo)產(chǎn)物收率，降低分離純化過(guò)程成本。提高目標(biāo)產(chǎn)物收率，降低分離純化過(guò)程成本。這是膨脹床吸附操作的最大誘人之處。這是膨脹床吸附操作的最大誘人之處。膨脹床與流化床的區(qū)別：膨脹床與流化床的區(qū)別：膨脹床并非傳統(tǒng)的流化床，兩者的區(qū)膨脹床并非傳統(tǒng)的流化床，兩者的區(qū)別在于：后者的吸附型粒子和液體在別在于：后者的吸

3、附型粒子和液體在床層內(nèi)混合程度高，吸附效率低，而床層內(nèi)混合程度高，吸附效率低，而前者的吸附劑粒子基本懸浮于固定的前者的吸附劑粒子基本懸浮于固定的位置，液體的流動(dòng)與固定床相似，接位置，液體的流動(dòng)與固定床相似，接近平推流，吸附效率高。因此，膨脹近平推流，吸附效率高。因此，膨脹床的形成需要特殊的吸附劑和設(shè)備結(jié)床的形成需要特殊的吸附劑和設(shè)備結(jié)構(gòu)。構(gòu)。操作流程操作流程緩沖液膨脹：緩沖液膨脹：首先確定適宜的膨脹度，使介質(zhì)顆粒在流動(dòng)的流體中首先確定適宜的膨脹度，使介質(zhì)顆粒在流動(dòng)的流體中分級(jí)。一般認(rèn)為，流速為分級(jí)。一般認(rèn)為，流速為100-300cm/h，使床層膨脹到固定床高度，使床層膨脹到固定床高度的兩倍時(shí)，

4、吸附性能最好；的兩倍時(shí)，吸附性能最好；進(jìn)料吸附：進(jìn)料吸附：利用多通道恒流泵，將緩沖液切換成原料液，根據(jù)流量利用多通道恒流泵，將緩沖液切換成原料液，根據(jù)流量計(jì)中轉(zhuǎn)子的位置和床層高度的關(guān)系調(diào)節(jié)流速，保持恒定的膨脹度進(jìn)計(jì)中轉(zhuǎn)子的位置和床層高度的關(guān)系調(diào)節(jié)流速，保持恒定的膨脹度進(jìn)行吸附，通過(guò)對(duì)流出液中目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)和分析，確定吸附終點(diǎn)；行吸附，通過(guò)對(duì)流出液中目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)和分析，確定吸附終點(diǎn)；洗滌：洗滌：在膨脹床中，用具有一定黏度的緩沖液沖洗吸附介質(zhì)，既沖在膨脹床中，用具有一定黏度的緩沖液沖洗吸附介質(zhì)，既沖走滯留在柱內(nèi)的細(xì)胞或細(xì)胞碎片，又可洗去弱吸附的雜質(zhì)，直至流走滯留在柱內(nèi)的細(xì)胞或細(xì)胞碎片，又可洗去弱

5、吸附的雜質(zhì)，直至流出液中看不到固體雜質(zhì)后，改用固定床操作；出液中看不到固體雜質(zhì)后，改用固定床操作；洗脫：洗脫：采用固定床操作，將配制好的洗脫劑用恒流泵從柱上部導(dǎo)入，采用固定床操作，將配制好的洗脫劑用恒流泵從柱上部導(dǎo)入，下部流出，分段收集，并分析檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的活性峰位置和最大活下部流出，分段收集，并分析檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的活性峰位置和最大活性峰濃度。性峰濃度。再生和清洗：再生和清洗：直接從渾濁液中吸附分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物如蛋白質(zhì)時(shí)，直接從渾濁液中吸附分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物如蛋白質(zhì)時(shí)，存在有非特異性吸附，雖經(jīng)洗滌、洗脫等步驟，有些雜質(zhì)可能還難存在有非特異性吸附，雖經(jīng)洗滌、洗脫等步驟，有些雜質(zhì)可能還難以除凈。為

6、提高介質(zhì)的吸附容量，必須進(jìn)行清洗使介質(zhì)再生，一般以除凈。為提高介質(zhì)的吸附容量，必須進(jìn)行清洗使介質(zhì)再生，一般在使床層膨脹到堆集高度在使床層膨脹到堆集高度5倍左右時(shí)的清洗液的流速下，經(jīng)過(guò)倍左右時(shí)的清洗液的流速下，經(jīng)過(guò)3小時(shí)小時(shí)的清洗，可以達(dá)到再生的目的。的清洗，可以達(dá)到再生的目的。蛋白質(zhì)在膨脹床吸附層析劑的蛋白質(zhì)在膨脹床吸附層析劑的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能胡洪波 姚善涇 朱自強(qiáng)(浙江大學(xué)化工學(xué)院生物化工研究所, 杭州310027)以牛血清白蛋白(BSA) 為目標(biāo)蛋白, 考察膨脹床用離子交換樹(shù)脂Streamline DEAE 的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能, 并和離子交換樹(shù)脂DEAE Sephar

7、ose FF 進(jìn)行比較, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者的靜態(tài)吸附性能相似,而動(dòng)態(tài)吸附性能差別較大。根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附數(shù)據(jù)計(jì)算出液膜擴(kuò)散系數(shù)和孔內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)。 膨脹床吸附層析技術(shù)自膨脹床吸附層析技術(shù)自90 年代被開(kāi)發(fā)以來(lái)年代被開(kāi)發(fā)以來(lái),由于在減少操作步驟由于在減少操作步驟, 提高產(chǎn)品收率提高產(chǎn)品收率, 降低純化費(fèi)用和資本投入方面的優(yōu)勢(shì)降低純化費(fèi)用和資本投入方面的優(yōu)勢(shì), 因而在生化分因而在生化分離中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛離中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛17 。St reamline DEAE 是是Amersham PharmaciaBiotech 公司專門(mén)為膨脹床設(shè)計(jì)的弱陰離子交換層析介公司專門(mén)為膨脹床設(shè)計(jì)的弱陰離子交換層析介質(zhì)質(zhì), 與常

8、用的離子交換層析劑不同的是與常用的離子交換層析劑不同的是, 它有一惰性石英砂內(nèi)核它有一惰性石英砂內(nèi)核, 6 %的交聯(lián)瓊脂糖被包在石英砂核外的交聯(lián)瓊脂糖被包在石英砂核外, 并且其密度和粒徑有一分布。并且其密度和粒徑有一分布。在利用該層析劑進(jìn)行分離時(shí)在利用該層析劑進(jìn)行分離時(shí), 研究靜態(tài)和動(dòng)態(tài)平衡吸附行為可以為研究靜態(tài)和動(dòng)態(tài)平衡吸附行為可以為考察層析劑對(duì)產(chǎn)物的吸附量和研究層析過(guò)程的傳質(zhì)速率考察層析劑對(duì)產(chǎn)物的吸附量和研究層析過(guò)程的傳質(zhì)速率, 提供一些提供一些必要的參數(shù)必要的參數(shù)。由于目前尚無(wú)計(jì)算具有粒徑分布且含惰性內(nèi)核吸附劑。由于目前尚無(wú)計(jì)算具有粒徑分布且含惰性內(nèi)核吸附劑的吸附動(dòng)力學(xué)模型和方法的吸附動(dòng)

9、力學(xué)模型和方法, 給描述動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程帶來(lái)了困難。本文給描述動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程帶來(lái)了困難。本文擬以擬以BSA 為目標(biāo)蛋白為目標(biāo)蛋白, 研究其在研究其在St ream2line DEAE 上的靜態(tài)和動(dòng)上的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能態(tài)吸附性能, 并與另一種層析劑并與另一種層析劑DEAE Sepharose FF 的吸附性能的吸附性能進(jìn)行比較進(jìn)行比較,試圖建立起蛋白質(zhì)在含惰性內(nèi)核層析劑吸附性能的數(shù)學(xué)模試圖建立起蛋白質(zhì)在含惰性內(nèi)核層析劑吸附性能的數(shù)學(xué)模型型, 計(jì)算吸附過(guò)程的平衡熱力學(xué)參數(shù)和擴(kuò)散系數(shù)。計(jì)算吸附過(guò)程的平衡熱力學(xué)參數(shù)和擴(kuò)散系數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料及方法實(shí)驗(yàn)材料及方法1. 1 1. 1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料BSA : BS

10、A : 華美生物工程公司華美生物工程公司; DEAE Sepharose; DEAE SepharoseFF , St reamline DEAE : FF , St reamline DEAE : 瑞典瑞典A. Pharmacia BiotechA. Pharmacia Biotech公司公司; ; 低溫恒溫槽低溫恒溫槽: : 寧波市機(jī)電工業(yè)研究設(shè)計(jì)院寧波市機(jī)電工業(yè)研究設(shè)計(jì)院; ;UV - 1 UV - 1 紫外檢測(cè)儀紫外檢測(cè)儀: : 瑞典瑞典A. Pharmacia Biotech A. Pharmacia Biotech 公司。公司。1. 2 1. 2 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1 1

11、. 2. 1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的測(cè)定BSA BSA 用紫外分光光度法分析用紫外分光光度法分析, , 波長(zhǎng)為波長(zhǎng)為280nm280nm。1. 2. 2 1. 2. 2 靜態(tài)吸附性能靜態(tài)吸附性能用緩沖液配制用緩沖液配制8. 0 mg/ mL 8. 0 mg/ mL 的標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)BSA BSA 溶液溶液, ,把其稀釋成不同濃度的溶液把其稀釋成不同濃度的溶液, , 取各濃度溶液取各濃度溶液15mL , 15mL , 置于置于25mL 25mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi)具塞錐形瓶?jī)?nèi), , 加入加入1mL 1mL 與緩與緩沖液沖液1111混勻的吸附劑混勻的吸附劑, , 置于恒溫水浴置于恒溫水浴161617h

12、 ,17h ,讓其達(dá)到平衡。將溶液離心讓其達(dá)到平衡。將溶液離心, , 取上清液取上清液, , 測(cè)定測(cè)定BSA BSA 的濃度的濃度, , 再根據(jù)物料衡算求得吸附劑吸附的再根據(jù)物料衡算求得吸附劑吸附的BSA BSA 量。量。1. 2. 3 1. 2. 3 動(dòng)態(tài)吸附性能研究動(dòng)態(tài)吸附性能研究動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)裝置如圖動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)裝置如圖1 1 所示。將吸附池置于所示。將吸附池置于恒溫水浴中恒溫水浴中, , 由一恒流泵連接吸附池和紫外檢測(cè)由一恒流泵連接吸附池和紫外檢測(cè)儀。恒流泵以恒定的流速通過(guò)紫外檢測(cè)儀的檢測(cè)池儀。恒流泵以恒定的流速通過(guò)紫外檢測(cè)儀的檢測(cè)池, , 再返回吸附池再返回吸附池, , 如如此循環(huán)此循

13、環(huán), , 直到記錄儀顯示平衡已到達(dá)為止。直到記錄儀顯示平衡已到達(dá)為止。 結(jié)語(yǔ)結(jié)語(yǔ) 考察了膨脹床離子交換層析介質(zhì)考察了膨脹床離子交換層析介質(zhì)St reamlineDEAE 的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能, 并和常用的離子交并和常用的離子交換層析介質(zhì)換層析介質(zhì)DEAE Sepharose FF 進(jìn)行比較進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)兩發(fā)現(xiàn)兩者靜態(tài)吸附性能比較相似者靜態(tài)吸附性能比較相似, 而動(dòng)態(tài)吸附性能差別較大。而動(dòng)態(tài)吸附性能差別較大。 提出具有粒徑分布和含有惰性內(nèi)核吸附劑的吸提出具有粒徑分布和含有惰性內(nèi)核吸附劑的吸附動(dòng)力學(xué)模型附動(dòng)力學(xué)模型, 采用正交配置法采用正交配置法, 解得了微分方程解得了微分方程

14、組解組解, 計(jì)算得到了兩種吸附劑的液膜擴(kuò)散系數(shù)和孔計(jì)算得到了兩種吸附劑的液膜擴(kuò)散系數(shù)和孔內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)內(nèi)擴(kuò)散系數(shù), 其中兩者的液膜擴(kuò)散系數(shù)相等其中兩者的液膜擴(kuò)散系數(shù)相等, 而而St reamline DEAE 的孔內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)要大于的孔內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)要大于DEAESepharose FF。 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1 胡洪波, 姚善涇, 朱自強(qiáng). 生化分離的新技術(shù)擴(kuò)張床吸附層析. 化學(xué)工程, 1999 , 27 : 37.2 Chase H A. Purification of proteins by adsorption chro2matography in expanded beds. Trends in

15、Biotech , 1994 ,12 : 296.3 Thoemmes J , Bader A , Halfar M , et al. Isolation ofmonoclonal antibodies from cell containing hybridoma brothusing a protein A coated adsorbent in expanded bed. JChromatogr A , 1996 , 752 : 111.4 Batt B C , Yabannavar V M , Singh V. Expanded bed ad2sorption process for p

16、rotein recovery from whole mammaliancell culture broth. Bioseparation , 1995 , 5 : 41.5 Chang Y K, Chase H A , Ion exchange purification ofG6PDH from unclarified yeast cell homogenate using ex2panded bed adsorption. Biotech Bioeng , 1996 , 49 : 204.6 Chang Y K, Chase H A , Development of an expanded

17、 bedtechnique for an affinity purification of G6PDH from unclar2ified yeast cell homogenates. Biotech Bioeng , 1995 , 48 :355.膨脹床吸附技術(shù)應(yīng)用在酵素的直接膨脹床吸附技術(shù)應(yīng)用在酵素的直接回收程序：以回收程序：以 -配醣酵素為例配醣酵素為例蘇家弘 張煜光 明志技術(shù)學(xué)院生化工程系摘要摘要本研究係發(fā)展一種新的酵素純化技術(shù)本研究係發(fā)展一種新的酵素純化技術(shù)-即膨即膨脹床吸附技術(shù)，從未澄清麵包酵母菌研磨脹床吸附技術(shù)，從未澄清麵包酵母菌研磨液中，有效的直接回收液中，有效的直接回收-配

18、醣酵素配醣酵素。 生物技術(shù)突飛猛進(jìn)，日新月異，已被公認(rèn)為二十一世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿χ萍?。而其?yīng)用範(fàn)圍函蓋醫(yī)學(xué)、食品、特用化學(xué)品、環(huán)保、能源等工業(yè)，以及農(nóng)林魚(yú)牧與海洋等產(chǎn)業(yè)，為人類帶來(lái)相當(dāng)多的福祉。而生化工程正是在研究此一問(wèn)題。生化工程之努力方向以生產(chǎn)高級(jí)產(chǎn)品為主，這是有別於其他傳統(tǒng)的工業(yè)，而目前有許多產(chǎn)品具有相當(dāng)?shù)纳虡I(yè)化潛力，但生化產(chǎn)品在下游分離純化步驟的費(fèi)用，約佔(zhàn)總消耗成本的70-80%1，對(duì)於產(chǎn)品的產(chǎn)能有其相當(dāng)大的影響。流體化床層析技術(shù)，是最近所開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種酵素純化方法，它具有相當(dāng)多的優(yōu)點(diǎn)，接下來(lái)將針對(duì)此法的特性、原理做探討，以及實(shí)際運(yùn)用在酵素純化程序之設(shè)計(jì)。2.1 材料材料STREAML

19、INE DEAE與STREAMLINE Phenyl樹(shù)脂購(gòu)自Pharmacia BioProcess Ltd.。其他所有化學(xué)試劑，購(gòu)自Sigma Chemical Co. 2.2 設(shè)備設(shè)備固定床層析管柱(HR 10/10, i.d. 1.0 cm)與膨脹床層析管柱(STREAMLINE 25, i.d. 2.5 cm)，購(gòu)自Pharmacia BioProcess Ltd.。層析系統(tǒng)Gradific system with pump p-50，購(gòu)自Pharmacia BioProcess Ltd.。紫外線分光光度計(jì)Model UV-1201，Shimadzu Scientific Instru

20、ments, Inc.。蠕動(dòng)幫浦Model 302S/R，購(gòu)自Watson-Marlow Co。破碎細(xì)胞溶液配製破碎細(xì)胞溶液配製將購(gòu)買的塊狀酵母與20mM磷酸鹽溶液(pH 8.0)配成50%重量百分濃度，再加入等重500m的玻璃珠，利用高速攪拌機(jī)在4,800rpm轉(zhuǎn)速將細(xì)胞打破2，每攪拌一分鐘，冷卻二分鐘，連續(xù)15次，完畢後，取出破碎酵母菌液，用緩衝溶液稀釋備用。酵素回收程序酵素回收程序?qū)⑦m量樹(shù)脂導(dǎo)入STREAMLINE 25管柱，使其固定床體積為60ml(樹(shù)脂高約12公分)。配合簡(jiǎn)易的蠕動(dòng)幫浦層析系統(tǒng)，在適當(dāng)流率注入緩衝溶液，使床膨脹至2倍高(約24公分)，然後注入適量非澄清的破碎酵母菌溶液(346ml)，再以10%甘油洗滌溶液去除管柱中的細(xì)胞雜質(zhì)，為保持床等高與穩(wěn)定性，因此操作過(guò)程中需要調(diào)整流速。待完全移除固體微粒，將床回覆至固定床高(約12公分)，選擇適當(dāng)鹽類溶液來(lái)沖提管柱，流出的菌液以自動(dòng)收集器收集之，離心後測(cè)定每根試管每毫升溶液中酵素的活性含量與蛋白質(zhì)總量。等溫吸附之探討等溫吸附之探討依Langmuir