免疫組化、免疫熒光、流式細胞術的應用比較及常見問題分析 (2)ppt課件

1、免疫組化、免疫熒光、免疫組化、免疫熒光、流式細胞術的運用比較流式細胞術的運用比較及常見問題分析及常見問題分析宋硯明宋硯明song_yanmingwuxiapptec免疫組化免疫組化IHCIHC的運用引見的運用引見免疫熒光免疫熒光IFIF的運用引見的運用引見流式細胞術流式細胞術FCFC的運用引見的運用引見IHCIHC、IFIF、FCFC區(qū)別與聯(lián)絡區(qū)別與聯(lián)絡免疫組織化學原理及特點免疫組織化學原理及特點利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標志利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標志技術，經(jīng)過化學反響使標志抗體顯色，對組織細技術，經(jīng)過化學反響使標志抗體顯色，對組織細胞內(nèi)的特異性抗原進展定位、定性、

2、定量檢測的胞內(nèi)的特異性抗原進展定位、定性、定量檢測的一門技術。一門技術。免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，定位準確，形狀與功能相結(jié)合等特點。定位準確，形狀與功能相結(jié)合等特點。免疫組織化學免疫組織化學Immunohistochemistry, IHCImmunohistochemistry, IHC細細 胞胞抗抗原原一一抗抗二二抗抗辣根過氧化物酶HRP3 3，3-3-二氨聯(lián)苯胺二氨聯(lián)苯胺DABDAB顯色劑顯色劑棕褐色絡合物IHC反響原理表示圖反響原理表示圖組織切片組織切片/芯片制造芯片制造2. 組織芯片運用領域組織芯片運用領域組織芯片的運用領域包

3、括與生命科學相組織芯片的運用領域包括與生命科學相關的根底研討、臨床研討、運用研討和關的根底研討、臨床研討、運用研討和新藥開發(fā)等。新藥開發(fā)等。免疫組化染色免疫組化染色IHC；原位雜交原位雜交ISH；熒光原位雜交熒光原位雜交FISH；原位末端標志分析原位末端標志分析TUNEL；原位原位PCR 以及激光捕獲顯微分別系統(tǒng)輔以及激光捕獲顯微分別系統(tǒng)輔助的助的cDNA雜交。雜交。1. 組織芯片組織芯片組織芯片或組織微陣列是將數(shù)十個組織芯片或組織微陣列是將數(shù)十個甚至上千個不同個體的組織標本集成在甚至上千個不同個體的組織標本集成在一張固相載體上，組織芯片中含有蛋白，一張固相載體上，組織芯片中含有蛋白，RNA及

4、及DAN分子，是一種高通量的研討分子，是一種高通量的研討分析工具。研討者一次可有效利用成百分析工具。研討者一次可有效利用成百上千份正常或疾病形狀下的組織標本來上千份正?；蚣膊⌒螤钕碌慕M織標本來研討特定基因及其所表達的蛋白質(zhì)與疾研討特定基因及其所表達的蛋白質(zhì)與疾病之間的關系。病之間的關系。3. Abgent 現(xiàn)有組織切片現(xiàn)有組織切片/芯片產(chǎn)品芯片產(chǎn)品全套鼠類器官組織切片；全套鼠類器官組織切片；全套猴類器官組織切片；全套猴類器官組織切片；人類常見癌癥組織切片；人類常見癌癥組織切片；組織芯片客戶定制效力。組織芯片客戶定制效力。組織芯片組織芯片/切片運用切片運用免疫組化流程表示圖免疫組化流程表示圖2.

5、 SP法法原理：根據(jù)生物素原理：根據(jù)生物素(Biotin) 與鏈霉親和與鏈霉親和素素(Streptavidin)具有強結(jié)合力的原理設具有強結(jié)合力的原理設計。在一抗兔源與鼠源與相應的靶計。在一抗兔源與鼠源與相應的靶抗原結(jié)合后，生物素化標志的抗多價二抗原結(jié)合后，生物素化標志的抗多價二抗與一抗特異結(jié)合；二抗上標志的生物抗與一抗特異結(jié)合；二抗上標志的生物素與標志了辣根過氧化物酶素與標志了辣根過氧化物酶HRP的的鏈霉親和素結(jié)合，構(gòu)成抗原特異性一鏈霉親和素結(jié)合，構(gòu)成抗原特異性一抗生物素化的二抗抗生物素化的二抗HRP 標志的鏈霉標志的鏈霉親和素復合物。親和素復合物。特點：該法孵育時間短通常為特點：該法孵育時

6、間短通常為10min，靈敏度高以及低背景染色等，靈敏度高以及低背景染色等特點。特點。1. SABC法法原理：原理：SABC法是利用鏈酶親和素法是利用鏈酶親和素(Streptavidin)與生物素與生物素(Biotin)特有的特有的高度親和力這終身物學性質(zhì)，先將生物高度親和力這終身物學性質(zhì)，先將生物素與辣根過氧化物酶素與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合，構(gòu)成結(jié)合，構(gòu)成生物素化生物素化HRP，然后與鏈酶親和素按一，然后與鏈酶親和素按一定比例混合，構(gòu)成定比例混合，構(gòu)成SABC復合物。用生復合物。用生物素化二抗與第一抗體結(jié)合，再與物素化二抗與第一抗體結(jié)合，再與SABC復合物結(jié)合構(gòu)成抗原抗體生復合物結(jié)合構(gòu)成

7、抗原抗體生物素化二抗物素化二抗 SABC復合物。最后用底復合物。最后用底物顯色劑顯色。物顯色劑顯色。特點：該法具有靈敏度高以及低背景染特點：該法具有靈敏度高以及低背景染色等特點。色等特點。3. Polymer酶標二抗法酶標二抗法原理：該法采用一段多聚氨基酸聚合物原理：該法采用一段多聚氨基酸聚合物做為載體鏈，將該多聚物與二抗結(jié)合，做為載體鏈，將該多聚物與二抗結(jié)合，然后可再標志上多個然后可再標志上多個HRP/AP酶分子，酶分子，所以同樣具有很高的信號放大作用。所以同樣具有很高的信號放大作用。特點：靈敏度高；操作步驟簡單；無需特點：靈敏度高；操作步驟簡單；無需進展內(nèi)源性的生物素封鎖。進展內(nèi)源性的生物

8、素封鎖。IHC二抗原理及選擇二抗原理及選擇4. 直接酶標二抗法直接酶標二抗法該法是將該法是將HRP/AP酶分子直接標志于二酶分子直接標志于二抗上。因此需求普通的酶標二抗即可完抗上。因此需求普通的酶標二抗即可完成。實驗簡單，本錢低，但是由于沒有成。實驗簡單，本錢低，但是由于沒有信號放大作用，所以對很多表達豐度不信號放大作用，所以對很多表達豐度不是很高的抗原就能夠檢測不到。是很高的抗原就能夠檢測不到。IHC常用酶標二抗原理表示圖常用酶標二抗原理表示圖2. AEC顯色法顯色法產(chǎn)品描畫：產(chǎn)品描畫：3-氨基氨基-9-乙基咔唑乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC) 是過氧化物

9、酶是過氧化物酶 (Peroxidase) 的顯色底物，在過氧化物的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，酶的催化下，AEC顯色任務液會于反響顯色任務液會于反響部位產(chǎn)生溶于酒精的紅色沉淀，必需在部位產(chǎn)生溶于酒精的紅色沉淀，必需在水溶性介質(zhì)中復染和封片。本試劑盒適水溶性介質(zhì)中復染和封片。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶用于辣根過氧化物酶HRP系統(tǒng)的免系統(tǒng)的免疫組化顯色，包括疫組化顯色，包括AEC顯色原和與之配顯色原和與之配套的稀釋液。套的稀釋液。試劑盒組成：試劑盒組成：AEC顯色原試劑顯色原試劑A AEC底物緩沖液試劑底物緩沖液試劑B1. DAB顯色法顯色法產(chǎn)品描畫：二氨基聯(lián)苯胺產(chǎn)品描畫：二氨基聯(lián)苯胺( 3

10、，3-diaminobenzidine，DAB ) 是過氧化物是過氧化物酶酶 (Peroxidase) 的顯色底物，在過氧化的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，物酶的催化下，DAB顯色任務液會于反顯色任務液會于反響部位產(chǎn)生不溶于酒精的棕褐色沉淀。響部位產(chǎn)生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶本試劑盒適用于辣根過氧化物酶HRP系統(tǒng)的免疫組化顯色。系統(tǒng)的免疫組化顯色。試劑盒組成：試劑盒組成：DAB顯色原顯色原20試劑試劑A DAB底物緩沖液底物緩沖液1試劑試劑B3. BCIP/NBT顯色法顯色法產(chǎn)品描畫：產(chǎn)品描畫：BCIP/NBT5-溴溴-4-氯氯-3-吲吲哚磷酸哚磷酸/氮藍四唑是一

11、種冷藏穩(wěn)定的、氮藍四唑是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、交、western blot、northern blot和和southern blot，特異性地與堿性磷酸酶，特異性地與堿性磷酸酶AP反響生成紫色物質(zhì)。反響生成紫色物質(zhì)。試劑盒組成：試劑盒組成：有機溶劑中的有機溶劑中的5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸和氮吲哚磷酸和氮藍四唑藍四唑IHC顯色方法原理及選擇顯色方法原理及選擇4. BCIP/INT顯色法顯色法產(chǎn)品描畫：產(chǎn)品描畫：BCIP/INT5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚磷酸磷酸/p-碘硝基四唑是一種冷藏穩(wěn)定的、碘硝基四唑是一種冷藏穩(wěn)定

12、的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、交、western blot、northern blot和和southern blot，特異性地與堿性磷酸酶，特異性地與堿性磷酸酶反響生成橙色反響生成橙色/棕褐色物質(zhì)。棕褐色物質(zhì)。 試劑盒組成：試劑盒組成：有機溶劑中的有機溶劑中的5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸和吲哚磷酸和p-碘硝基四唑碘硝基四唑免疫組織化學結(jié)果分析免疫組織化學結(jié)果分析2.非特異性顯色非特異性顯色石蠟切片脫蠟不徹底，建議延伸脫蠟時石蠟切片脫蠟不徹底，建議延伸脫蠟時間。間。操作過程中沖洗不充分，建議添加沖洗操作過程中沖洗不充分，建議添加沖洗的次數(shù)與沖洗時

13、間。的次數(shù)與沖洗時間。組織富含內(nèi)源性的生物素與過氧化物酶，組織富含內(nèi)源性的生物素與過氧化物酶，建議運用相關試劑進展封鎖。建議運用相關試劑進展封鎖。發(fā)生抗原異位。發(fā)生抗原異位。蛋白封鎖不充分，建議添加蛋白封鎖時蛋白封鎖不充分，建議添加蛋白封鎖時間。間。1.顯色過深顯色過深一抗?jié)舛冗^高或孵育時間過長，建議降一抗?jié)舛冗^高或孵育時間過長，建議降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時間。低一抗?jié)舛然驕p少孵育時間。孵育溫度過高，建議室溫或孵育溫度過高，建議室溫或4孵育。孵育。HRP標志二抗孵育時間過長，建議縮短標志二抗孵育時間過長，建議縮短時間。時間。3.顯色強度弱顯色強度弱一抗?jié)舛冗^低或孵育時間過短，建議添一抗?jié)舛冗^低

14、或孵育時間過短，建議添加一抗?jié)舛然蜓由旆跤龝r間。加一抗?jié)舛然蜓由旆跤龝r間。試劑超越保質(zhì)期，建議實驗前確認試劑試劑超越保質(zhì)期，建議實驗前確認試劑的保質(zhì)期。的保質(zhì)期。操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。免疫組織化學常見問題分析免疫組織化學常見問題分析4.無染色無染色組織中無目的抗原的表達。組織中無目的抗原的表達。一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認一抗的種屬來源。前確認一抗的種屬來源。顯色物質(zhì)與顯色物質(zhì)與HRP系統(tǒng)不匹配，建議實驗系統(tǒng)不匹配，建議實驗前確認顯色體系。前確認顯色體系。免疫熒光原理及特點免疫熒光原理及特點免疫熒光就是利用

15、抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標志技術，經(jīng)過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯光素標志技術，經(jīng)過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下察看熒光的變化從而對細胞內(nèi)的抗原進展分析的技術。微鏡下察看熒光的變化從而對細胞內(nèi)的抗原進展分析的技術。用免疫熒光顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方用免疫熒光顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞或組織技術。法稱為免疫熒光細胞或組織技術。免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。免疫熒光免疫熒光Immunofluoresc

16、ence, IFImmunofluorescence, IF免疫熒光原理表示圖免疫熒光原理表示圖免疫熒光實驗過程免疫熒光實驗過程 細胞爬片多聚賴氨酸處置，生長密度細胞爬片多聚賴氨酸處置，生長密度70-80%70-80% 細胞固定適宜的固定液，如細胞固定適宜的固定液，如4%4%甲醛溶液等甲醛溶液等 細胞膜穿透細胞膜穿透 Triton X-100 Triton X-100 等等 封鎖封鎖3%BSA-PBS3%BSA-PBS等等 一抗孵育一抗孵育 熒光二抗孵育熒光二抗孵育 胞漿胞漿/ /核襯染鬼筆環(huán)肽核襯染鬼筆環(huán)肽/DAPI/PI/DAPI/PI 封片熒光顯微鏡拍照封片熒光顯微鏡拍照 免疫熒光結(jié)果分

17、析免疫熒光結(jié)果分析免疫熒光雙染色抗體的選擇免疫熒光雙染色抗體的選擇直接法：直接法：一抗種屬來源無要求一抗種屬來源無要求標志兩種不同熒光素的標志兩種不同熒光素的一抗。一抗。間接法：間接法：一抗種屬來源來源不同一抗種屬來源來源不同二抗分別標志不同熒光二抗分別標志不同熒光素。素。細胞核襯染染料：細胞核襯染染料：DAPIDAPI是一種可以與是一種可以與DNADNA強力結(jié)合的熒光染料它可以透過完好的細胞膜，因此強力結(jié)合的熒光染料它可以透過完好的細胞膜，因此以用于活細胞和固定細胞的染色。最大吸收波長為以用于活細胞和固定細胞的染色。最大吸收波長為358nm358nm，最大發(fā)射波長為，最大發(fā)射波長為461nm

18、461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。Hoechst 33342 Hoechst 33342 是一種是一種DNADNA結(jié)合型熒光染料結(jié)合型熒光染料, ,可以嵌合到堿基分子中可以嵌合到堿基分子中, ,在紫在紫外激發(fā)光作用下發(fā)出蘭色熒光外激發(fā)光作用下發(fā)出蘭色熒光. .可以透過完好的細胞膜，可用于活細胞染色。可以透過完好的細胞膜，可用于活細胞染色。碘化丙啶碘化丙啶(PI)(PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNADNA后釋放紅色熒光。后釋放紅色熒光。雖然雖然PIPI不能經(jīng)過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜

19、而對核染色。不能經(jīng)過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。PI-DNAPI-DNA復合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為復合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm535nm和和 615nm 615nm。細胞漿襯染染料：細胞漿襯染染料：鬼筆環(huán)肽鬼筆環(huán)肽phalloidin phalloidin 由鬼筆鵝膏真菌由鬼筆鵝膏真菌Amanita phalloidesAmanita phalloides產(chǎn)生產(chǎn)生的一種環(huán)肽。可與的一種環(huán)肽?？膳cF F肌動蛋白結(jié)合，使肌動蛋白結(jié)合，使F F肌動蛋白堅持穩(wěn)定。其熒光標志物肌動蛋白堅持穩(wěn)定。其熒光標志物是鑒定是鑒定F F肌動蛋白的重要試劑。肌動蛋白的重要試劑。熒光抗體的選

20、擇：熒光抗體的選擇：綠色熒光素：綠色熒光素：FITCFITC，Alex488Alex488，Dylight488Dylight488等。等。紅色熒光素：紅色熒光素：PEPE，Alex546Alex546等。等。各種熒光染料原理及選擇各種熒光染料原理及選擇2.信號弱或無信號信號弱或無信號無目的蛋白或表達量極少，建議選用表無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞或組織。達量高的細胞或組織。細胞通透性差，建議添加通透劑的作用細胞通透性差，建議添加通透劑的作用時間或濃度。時間或濃度。一抗一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。二抗?jié)舛忍停ㄗh增大其濃度。二抗選擇錯誤種屬不匹配，建議選二抗選擇錯誤種

21、屬不匹配，建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。用與一抗種屬相匹配的二抗。1.背景過高背景過高一抗質(zhì)量不高，建議運用特異性高、效一抗質(zhì)量不高，建議運用特異性高、效價高的一抗。價高的一抗。一抗一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗二抗?jié)舛忍撸ㄗh降低一抗/二抗二抗?jié)舛?。濃度。封鎖不完全，建議添加蛋白封鎖時間。封鎖不完全，建議添加蛋白封鎖時間。洗滌不充分，建議添加沖洗次數(shù)與時間。洗滌不充分，建議添加沖洗次數(shù)與時間?？山?jīng)過調(diào)理熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背可經(jīng)過調(diào)理熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背景。景。3.熒光猝滅快熒光猝滅快熒光素本身特性決議，光穩(wěn)定性差，建熒光素本身特性決議，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗

22、。議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。用普通的封片劑封片，建議選用防熒光用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。猝滅劑封片。免疫熒光常見問題分析免疫熒光常見問題分析4.細胞有自發(fā)熒光細胞有自發(fā)熒光運用了戊二醛固定，建議在固定后熒光運用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進展熒光淬滅，如運用染色前進展熒光淬滅，如運用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。光。資料本身如石蠟有自發(fā)熒光，建議資料本身如石蠟有自發(fā)熒光，建議設立陰性對照，經(jīng)過降低熒光顯微鏡的設立陰性對照，經(jīng)過降低熒光顯微鏡的參數(shù)來消除背景染色。參數(shù)來消除背景染色。 細胞成分中可以產(chǎn)生自發(fā)熒光的

23、分子細胞成分中可以產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子例如核黃素、細胞色素等的含量高；例如核黃素、細胞色素等的含量高；培育細胞中死細胞活細胞比例高；培育細胞中死細胞活細胞比例高；流式細胞術定義及原理流式細胞術定義及原理流式細胞儀流式細胞儀FLOW CYTOMETORFLOW CYTOMETOR： 進展流式細胞分析的儀器，是集光電子物理，光電丈量，進展流式細胞分析的儀器，是集光電子物理，光電丈量，計算機，細胞熒光化學，抗體技術為一體的高科技細胞計算機，細胞熒光化學，抗體技術為一體的高科技細胞分析儀。分析儀。流式細胞術流式細胞術FLOW CYTOMETRYFLOW CYTOMETRY: : 利用流式細胞儀對處于快速

24、流動的細胞或生物顆粒進展多利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進展多參數(shù)、快速每秒可達參數(shù)、快速每秒可達1000-100001000-10000個的定量分析和分個的定量分析和分選純度可達選純度可達99%99%以上的技術。以上的技術。流式細胞術流式細胞術Flow Cytometry, FCFlow Cytometry, FC細細 胞胞抗抗原原一一抗抗二二抗抗熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)FITC,PEFITC,PE等等不同顏色的不同顏色的激發(fā)光激發(fā)光FCFC反響原理表示圖反響原理表示圖激光源激光源轉(zhuǎn)化為計算機轉(zhuǎn)化為計算機識別數(shù)據(jù)識別數(shù)據(jù)流式細胞儀任務原理圖流式細胞儀任務原理圖流式細胞術實驗過程流式細胞

25、術實驗過程 細胞懸浮液制備濃度為細胞懸浮液制備濃度為1 15 5106106個個/ml/ml 細胞固定適宜的固定液，如細胞固定適宜的固定液，如4%4%甲醛溶液等甲醛溶液等 細胞膜穿透細胞膜穿透 冰冷的甲醇等冰冷的甲醇等 封鎖封鎖3%BSA-PBS3%BSA-PBS等等 一抗孵育一抗孵育 熒光二抗孵育熒光二抗孵育 流式細胞儀分析流式細胞儀分析人外周全血細胞雙參數(shù)散點圖人外周全血細胞雙參數(shù)散點圖直方圖：單參數(shù)分析直方圖：單參數(shù)分析流式細胞術常見結(jié)果分析流式細胞術常見結(jié)果分析散點圖：多參數(shù)分析散點圖：多參數(shù)分析常用細胞表型及意義：常用細胞表型及意義：Cluster of Cluster of Dif

26、ferentiation, CDDifferentiation, CDCD3 CD3 總總T T細胞細胞CD4 TCD4 T輔助輔助/ /誘導細胞亞群誘導細胞亞群CD8 TCD8 T抑制抑制/ /細胞毒細胞亞群細胞毒細胞亞群CD19 BCD19 B細胞抗原細胞抗原LL: CD3-CD4- B細胞群細胞群+細細胞毒胞毒T細胞亞群細胞亞群LR：CD3+CD4- 細胞毒細胞毒T細胞細胞亞群亞群UR：CD3+CD4+ T輔助細胞輔助細胞亞群亞群UL 0.70 UR 24.2LR22.3LL 52.80 熒光補償示原理熒光補償示原理熒光補償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器出去除匹配熒光以外的任何熒光信

27、號。當采用兩種或兩種以上熒光標志時如FITC,PE，當攜帶兩種熒光素的細胞遭到激光照射激發(fā)時，將發(fā)出兩種不同波長的熒光。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會有一定的重疊。因此就會呵斥不同通道之間的熒光干擾，對實驗結(jié)果呵斥影響。熒光補償表示圖熒光補償表示圖Annexin V-FITC/PI凋亡檢測原理凋亡檢測原理在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸Phosphatidylserine，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的外表，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin V是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin V進展熒光素FITC、PE或Biotin標志，以標志了的Annexin V-FITC作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶Propidium Iodide，PI是一種核酸染料，它不能透過完好的細胞膜，但在細胞凋亡