第九講 電泳與膜分離 6學(xué)時(shí)

1、第九講 電泳與膜分離6學(xué)時(shí)一、 通過本章學(xué)習(xí)應(yīng)掌握的內(nèi)容1、 膜分離的概念2、 膜的概念3、 膜分離技術(shù)的分類4、 基本的膜材料有哪些？5、 常用的膜組件有哪些？6、 何謂反滲透？實(shí)現(xiàn)反滲透分離的條件是什么？7、 強(qiáng)制膜分離的概念？8、 電滲析的工作原理？9、 電泳的概念10、 電泳的基本原理11、 電泳技術(shù)的分類12、 基本的電泳系統(tǒng)組成13、 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理14、 SDS PAGE的分離原理15、 何謂等電聚焦？如何形成載體兩性電解質(zhì)pH梯度？16、 何謂雙相電泳？其作用是什么？二、膜分離技術(shù)1、 膜分離的概念利用膜的選擇性（孔徑大?。?，以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，

2、由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。2、 膜的概念（1）在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜。（2）膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構(gòu)成的復(fù)合體（3）被膜分開的流體相物質(zhì)是液體或氣體（4）膜的厚度應(yīng)在0.5mm以下，否則不能稱其為膜。3、 膜分離技術(shù)的類型和定義膜分離過程的實(shí)質(zhì)是物質(zhì)透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目的，故而可以按分離粒子大小進(jìn)行分類：（1）微濾：以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力為推動(dòng)力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，孔徑分布范圍在0.02514m之間；（2）超濾：分離介質(zhì)

3、同上，但孔徑更小，為0.0010.02 m，分離推動(dòng)力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)；（3）反滲透：是一種以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在0.00010.001 m之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）；（4）納濾：以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離3001000小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均2nm；（5）電滲析：以電位差為推動(dòng)力，利用離子交換膜的選擇透過性，從溶液中脫除或富集電解質(zhì)的膜分離操作；4、 膜的分類u按孔徑大?。何V膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜u按膜結(jié)構(gòu)：對稱性膜、不對稱膜、復(fù)合膜u按材料分：合成有

4、機(jī)聚合物膜、無機(jī)材料膜5、 膜材料的特性對于不同種類的膜都有一個(gè)基本要求：（1）耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在0.10.5Mpa，反滲透膜的壓力更高，約為110MPa（2）耐高溫:高通量帶來的溫度升高和清洗的需要（3）耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解；（4）化學(xué)相容性：保持膜的穩(wěn)定性；（5）生物相容性：防止生物大分子的變性；（6）成本低；6、 各種膜材料（1）有機(jī)高分子膜：纖維素酯膜、縮合系聚合物（聚砜類）、聚烯烴及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯；（2）無機(jī)多孔膜：陶瓷膜7、 膜組件（1）管

5、式（2）中空纖維（3）螺旋卷繞式（4）平板式共同的特點(diǎn)（1）盡可能大的膜表面積（2）可靠的支撐裝置（3）可引出透過液（4）膜表面濃度差極化達(dá)到最小8、超濾和反滲透目的：將溶質(zhì)通過一層具有選擇性的薄膜，從溶液中分離出來分離時(shí)的推動(dòng)力都是壓強(qiáng)，由于被分離物質(zhì)的分子量和直徑大小差別及膜孔結(jié)構(gòu)不同，其采用的壓強(qiáng)大小不同。反滲透膜的操作壓力高達(dá)10 MPa超濾和反滲透操作中的滲透壓由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜把兩種不同濃度的溶液隔開（淡水或鹽水），因此都存在滲透壓。滲透壓的大小取決于溶液的種類、濃度和溫度；一般說來，無機(jī)小分子的滲透壓要比有機(jī)大分子溶質(zhì)的滲透壓高得多。9、滲透與反滲透滲透是由于存

6、在化學(xué)勢存在梯度而引起的自發(fā)擴(kuò)散現(xiàn)象。溶液中水的化學(xué)勢溶液中水的活度純水的化學(xué)勢因此，通常情況下，其結(jié)果是水從純水一側(cè)透過半透膜向溶液側(cè)滲透，使后者的液位抬高。如果在溶液一側(cè)施加壓力，外界力做功使溶液中水的化學(xué)勢升高，則純水通過膜的滲透就會(huì)逐漸減小，并最終停止（條件？），此時(shí)的壓力差就是溶液的滲透壓。當(dāng)時(shí)，水將從溶液一側(cè)向純水一側(cè)移動(dòng)，此種滲透稱之為反滲透。10、實(shí)現(xiàn)超濾和反滲透的條件u超濾：需要增加流體的靜壓力，改變天然過程的方向，才可能發(fā)生含有低分子量化合物的溶劑流通過膜，此時(shí)的推動(dòng)力是流體靜壓力與滲透壓的壓差；u反滲透：過程類似于超濾，只是純?nèi)軇┩ㄟ^膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操

7、作壓力比超濾大得多。u因此，超濾和反滲透通常又被稱之為“強(qiáng)制膜分離過程”11、超濾的基本方程Lp：穿透度（單位時(shí)間、單位膜面積的處理量）12、納米膜過濾技術(shù)介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機(jī)小分子而使大部分無機(jī)鹽通過；特點(diǎn)：（1）在過濾分離過程中，能截留小分子有機(jī)物，并可以同時(shí)透析除鹽，集濃縮與透析為一體；（2）操作壓力低13、電滲析技術(shù)電滲析技術(shù)是在直流電場的作用下，由于離子交換膜的阻隔作用，實(shí)現(xiàn)溶液的淡化和濃縮，分離推動(dòng)力是靜電引力。三、電泳技術(shù)1、電泳概念A(yù)rne Tiselius物理化學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)金獲得者定義荷電的膠體粒子在電場中的移動(dòng)；電泳決定于環(huán)繞每個(gè)離子的離子霧中的擴(kuò)散雙電層，

8、離子尺寸越大、溶液中的離子強(qiáng)度越高時(shí)，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢和雙電層的因素起著決定性的作用。2、電泳的原理蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子的相互作用。帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。3、電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時(shí)間t中的遷移距離d。其單位是cm2·sec-1 ·V-1電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質(zhì)的基礎(chǔ)4、電泳的大致分類依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)（1）移動(dòng)界面

9、電泳（moving boundary electrophoresis）（2）區(qū)帶電泳（zone electrophoresis ）（3）穩(wěn)態(tài)電泳（steady state electrophoresis ）其中以區(qū)帶電泳為目前常用的電泳系統(tǒng)。5、區(qū)帶電泳的主要技術(shù)具有支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳具有防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，可使被分離的成分得到最大分辨率的分離；區(qū)帶電泳中的常用技術(shù)載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳無載體電泳：自由電泳、毛細(xì)管電泳6、凝膠電泳作為電泳支持介質(zhì)必須具有：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性。凝膠電泳的支持介質(zhì)：（1）聚

10、丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PGA）由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成；（2）瓊脂糖凝膠：從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結(jié)構(gòu)大部分是由1，3連接的-D吡喃半乳糖和1，4連接的3，6脫水-D吡喃半乳糖交替形成的；8、 丙烯酰胺的聚合烯酰胺的聚合通常是由化學(xué)或光化學(xué)過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)是自由基催化的氧化-還原過程。丙烯酰胺的化學(xué)聚合是由過硫酸銨在堿性條件下，產(chǎn)生游離氧自由基引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基

11、狀態(tài)，經(jīng)過一系列的自由基反應(yīng)得到的聚合物；9、 影響聚合的主要因素（1）引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢；濃度過大則易導(dǎo)致電泳時(shí)的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在4060分鐘內(nèi)完成。（2）系統(tǒng)pH值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個(gè)最佳pH值，以獲得最佳的聚合結(jié)果；（3）溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；（4）分子氧：分子氧的存在會(huì)阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣（5）系統(tǒng)純度：金屬離子會(huì)影響凝膠的聚合；10、聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應(yīng)在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴(kuò)

12、散減到最小。凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（size sieving capacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應(yīng)（molecular sieving effect）-+CBA圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖分子量大小依次為MA=MB>MC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。11、瓊脂糖凝膠的性能、結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)（1）瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。（2）機(jī)械強(qiáng)度高：可以在濃度1%以下使用；（3）無毒；（4）染色、脫色

13、程序簡單，背景色較低；（5）熱可逆性；（6）生物中性：一般不與生物材料結(jié)合；（7）電內(nèi)滲（EEO）大：對于對流電泳有益12、電泳系統(tǒng)的基本組成（1）電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽（2）電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳10002000V，固相梯度等電聚焦30008000V（3）外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會(huì)產(chǎn)生高熱，需冷卻；（4）凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥；（5）灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；（6）電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如PVDF膜（7）電泳洗脫儀：

14、回收樣品（8）凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而給出定量的結(jié)果。13、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）原理由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴(kuò)散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動(dòng)參與生物分子的分離，具有分子篩效應(yīng)。因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，在電泳過程中不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳（2）電泳前的準(zhǔn)備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：（a）保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持；（b）電泳時(shí)間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進(jìn)行，但實(shí)際上過

15、酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應(yīng)限制在310之間。緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標(biāo)準(zhǔn)的對立權(quán)衡（a）如果緩沖液的pH選擇在遠(yuǎn)離樣品中各種蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時(shí)間短，區(qū)帶細(xì)而窄；（b）如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高；因此，常常選擇pH 8.09.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH 8.39.5），Tris-硼酸(pH 8.39.3)和Tris-醋酸（pH 7.28.5）凝膠濃度的選擇由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，凝膠的

16、分子篩效應(yīng)（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為：（a）非排阻性凝膠（unrestrictive gel）:濃度0.7 1.0%的瓊脂糖凝膠；（b）排阻性凝膠（restrictive gel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時(shí)蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置；凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進(jìn)，不能得到很好的分離；PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠；樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適

17、的樣品濃度（12mg/L，考染），加樣（溴酚藍(lán)）；電泳：46小時(shí)，待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)陽極底部；檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍(lán)R-250、銀染色靈敏度比考染高100倍、熒光探針）；照相、凝膠干燥；定量測定；14、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的測定；特點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作簡便、測定快速、重復(fù)性高、樣品無需純化。（1）SDS-PAGE 的原理蛋白質(zhì)分子的解聚SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)；而強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、-巰基乙醇能使半胱

18、氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時(shí)，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。（2）未知蛋白質(zhì)分子量的測定基于上述SDS-PAGE的原理介紹，我們可以利用SDS-PAGE電泳進(jìn)行未知蛋白質(zhì)的分子量測定；以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷移率，制作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測定

19、遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的分子量；15、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦等電聚焦（isoelectrofocusing）, IEF利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質(zhì)梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。（1）工作原理蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負(fù)電，只是在某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點(diǎn)（iso

20、electric point pI）。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)取決于它的氨基酸組成和構(gòu)象，是一個(gè)物理化學(xué)常數(shù)?？梢岳玫入婞c(diǎn)差異來進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離、分析 （2）載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦原理載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦就是在支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當(dāng)帶電的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入該體系時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生移動(dòng)，并聚集于相當(dāng)于其等電點(diǎn)的位置。載體兩性電解質(zhì)和pH梯度的形成等電聚焦技術(shù)的關(guān)鍵在于pH梯度的建立載體兩性電解質(zhì)的概念：作為載體兩性電解質(zhì)應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：（a）應(yīng)該是兩性的，使它們在分離柱中也能達(dá)到一個(gè)平衡位置；（b）應(yīng)該可以作為“載體”，兩性電解質(zhì)不能用于等電聚