細胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗體的制備與鑒定

1、細胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗體的制備與鑒定                   作者：劉海英, 楊微, 武正華, 唐曉波, 朱大嶺【關鍵詞】  CYP3A4;,合成肽;,多克隆抗體,摘 要  目的: 制備兔抗人細胞色素P450 3A4（CYP3A4）抗體及其特性鑒定。方法: 利用生物信息學方法分析CYP3A4蛋白的序列, 根據親水性、 抗原性、 柔韌性及表面性等指標選擇多肽序列,

2、合成CYP3A4多肽, 與載體蛋白鑰孔戚血藍素（KLH）偶聯(lián), 免疫日本大耳白兔制備抗CYP3A4抗體。辛酸硫酸銨法純化抗體, 間接ELISA測定抗體的效價及相對親和力常數(shù), Western blot鑒定其特異性, 免疫組化進行定位。結果: 獲得針對小分子CYP3A4的抗體。該抗體效價為116000; 相對親和力常數(shù)在105106 M-1, 具有實用價值; 可與CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出現(xiàn)特異性反應; 可識別正常人肝臟組織CYP3A4; Western blot的結果顯示, 該抗體識別的相應抗原的相對分子質量（Mr）為46000。結論: 合成的多肽KLH復合物具有免疫原性, 可用于

3、制備相應的抗體。制備的兔抗CYP3A4合成肽抗體可應用于ELISA、 Western blot和免疫組化實驗。關鍵詞CYP3A4; 合成肽; 多克隆抗體     細胞色素3A4(CYP3A4)是細胞色素P450 超家族成員之一, 主要存在于肝臟中、 小腸中。它是人類藥物代謝酶中的最重要的酶, 在臨床上超過半數(shù)的藥物完全或部分地被該酶代謝1。CYP3A4與外源性致癌物、 抗癌藥物和內源性類固醇激素、 維生素、 脂肪酸的代謝轉化密切相關2, 3。目前, 國外已研制出抗CYP3A4的抗體并且應用試驗中; 而國內在研制CYP450抗體領域屬于空白階段, 我們研制出針對27

4、8-292 位的抗人CYP3A4抗體, 并將對CYP3A4功能的研究、 體外藥物代謝及對其基因表達調控的腫瘤防治提供新的思路。1  材料和方法1.1  材料  日本大耳白兔,  雄性, 6周齡, 由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供。福氏佐劑及3,3,5,5四甲基聯(lián)苯胺（TMB）均購自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG購自Jackson ImmunoResearch公司。牛血清白蛋白（BSA）購自Solarbio公司。硝酸纖維素膜（NC）購自BIORAD公司。ECL Plus購自Amersham Biosciences公司。即用型SABC免疫組化試劑盒購自

5、武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產分析純。多肽合成及其與KLH、 BSA的聯(lián)接由北京中科亞光生物有限公司完成。正常人肝臟組織, 由“人類肝臟蛋白質組計劃”項目提供。 1.2  方法 1.2.1  CYP3A4抗原表位的分析  由SWISS PROT網站獲知CYP3A4蛋白的序列, 然后利用DNAStar軟件分析其序列的特點, 確定278-292位15個氨基酸作為欲合成的多肽序列: SQNSKETESHKALSD。1.2.2  CYP3A4多肽的合成及其與KLH和BSA的交聯(lián)  CYP3A4多肽由北京中科亞光生物有限公司合成; 獲得的多

6、肽經常規(guī)C18的RP2HPLC柱進行純化, 純度達95%。CYP3A4與KLH和BSA的交聯(lián)采用戊二醛連接法, 將5 mg合成多肽分別加入7 mg KLH和BSA中, 邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的3 g/L的戊二醛溶液（1 mL）, 室溫作用2 h。以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜, 交聯(lián)成CYP3A4KLH、 CYP3A4BSA偶聯(lián)物。1.2.3  兔抗CYP3A4多肽抗體的制備  每只取200 g多肽KLH偶聯(lián)物與等量的完全福氏佐劑充分乳化后, 于兔背部皮下多點注射, 每點約100 g。2 周后加強免疫, 劑量同前, 用不完全福氏佐劑充分乳化后, 于兔背部皮下多點注射; 以

7、后隔2周加強1次; 從第3次加強免疫開始, 每次免疫后7 d, 經耳緣靜脈采血測定抗體的效價4, 5。經4次加強免疫后, 符合要求, 立即頸動脈取血。分離血清后, 無菌分裝保存于-80備用。1.2.4  人肝臟微粒體蛋白制備  取10 g正常人的肝臟、 剪碎, 用磷酸鉀鹽緩沖液反復沖洗除去血紅蛋白后, 加入上述磷酸鉀鹽緩沖液制成肝勻漿。然后將肝勻漿依次于4以10000 g離心30 min, 取上清液, 以30000 g 離心60 min, 取上清液及100000 g離心60 min, 取沉淀后, 懸浮于磷酸鉀鹽緩沖液（含有200 mL/L甘油, 5 g/L膽酸鈉, 2 mg

8、/L抑肽酶, 2 mg/L亮肽素, 1 mg/L胃酶抑素及1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中, 用Bradford法進行蛋白定量。分裝后, 置于-80冰箱內貯存?zhèn)溆谩?.2.5  抗血清的純化  用醋酸鈉緩沖液（60 mmol/L, pH=4.0）將抗血清稀釋34倍, 0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH至4.5, 緩慢滴加辛酸至濃度為25 mL/L, 室溫攪拌30 min。4 10000 g離心30  min, 棄沉淀后濾膜（0.22 m）過濾, 加入1/10體積的10×PBS, 用0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH至7.4, 緩慢加入預冷的飽和硫酸銨

9、至45%飽和度, 混合后4過夜。4 3000 g離心30 min, 棄上清后, 用0.01 mol/L PBS（pH=7.4）重懸, 透析過夜。用Branford法進行蛋白定量。經SDSPAGE分離后, 用BIORAD quantity one軟件分析其純度。1.2.6  ELISA檢測抗血清效價  ELISA檢測板用以多肽BSA偶聯(lián)物以1 mg/L的濃度包被, 每孔100 L, 4孵育過夜后, 用10 mL/L的牛血清封閉, 每孔200 L, 37 2 h后, 洗滌備用。取出包被好的檢測板, 每孔加入按12梯度稀釋的抗血清100 L (對照為正常兔血清) , 37孵育30

10、 min, 洗滌3次后每孔加入1 5000 稀釋的HRP 標記的羊抗兔IgG 100 L, 37孵育15 min, 洗滌3次后進行TMB顯色, 37孵育15 min, 終止反應后, 用酶標儀式測定樣品A450值.百事通 1.2.7  間接 ELISA檢測抗血清親和常數(shù)  ELISA檢測板分別用多肽交聯(lián)BSA包被成5 mg/L 和10 mg/L, 封閉后加入倍比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的多抗, 再加入HRP 標記的羊抗兔IgG二抗, TMB顯色測定A450。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標, A值為縱坐標作圖。以曲線達到水平的A值為100%, 求出A50 即50%A值時對應的抗體濃

11、度.按照Kaf f=(n1)/2(nAb t2Abt)算出抗體親和常數(shù), 其中Abt 、 Abt指的是A50時即包被分別5 mg/L和10 mg/L時抗體半飽和時抗體的摩爾濃度, Agt, Agt指的是包被的抗原濃度本實驗中即指10 g和5 g, n=Agt/Agt, 本實驗中n=26。1.2.8  多克隆抗體的Western blot分析  用2×SDS上樣緩沖液懸浮制備的人肝臟微粒體蛋白、 多肽BSA及BSA, 于95加熱5 min, 置于冰上冷卻10 min。上樣量分別為70、 15和15 g, 經SDSPAGE分離后, 以濕轉法電轉至硝酸纖維素膜上。經脫脂

12、奶粉封閉（室溫1 h）后, 依次滴加11000稀釋抗血清（4過夜, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次）及110000 HRP山羊抗兔IgG（室溫孵育1 h, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次）。用化學發(fā)光劑試劑盒（ECL Plus）處理5 min后, 于暗室曝光到X膠片上顯影、 定影。1.2.9  多克隆抗體的免疫組化染色  取出用丙酮固定的冰凍人正常肝臟組織切片, 滴加50 g/L BSA, 室溫下封閉20 min, 加入11000稀釋兔抗人CYP3A4多肽抗體, 4孵育過夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgGHRP, 37孵育20 min, PBS

13、洗片后進行DAB顯色, 蘇木素復染, 返藍后, 脫水、  透明、 封片, 鏡檢, 放大400倍拍照記錄結果7。2  結果2.1  CYP3A4的氨基酸序列分析  用DNAStar軟件對蛋白序列進行分析（圖1）, 根據親水性、 抗原性、 表面性及柔韌性4個參數(shù)預測的結果進行綜合考慮, 選取欲合成的多肽序列為278-292位氨基酸（圖中陰影區(qū)）: SQNSKETESHKALSD。 圖1  DNAstar軟件對人CYP3A4蛋白序列參數(shù)的預測略2.2  CYP3A4合成肽抗原的合成與純化  化學合成的多肽經HPLC純化后

14、, 純度可達95%, 交聯(lián)KLH后可作為抗原免疫動物。2.3  抗血清的特性鑒定  效價測定: 間接ELISA法檢測表明, 抗血清的效價為116000。相對親和力常數(shù)測定: 純化抗血清按12的蛋白濃度倍比稀釋, 繪制標準曲線如圖2所示, 結果表明相對親和力常數(shù)在105106 M-1?？贵w特異性鑒定: 以制備的人肝臟微粒體蛋白、 多肽BSA、 BSA作為抗原, 以兔抗血清作為一抗進行Western blot分析顯示,    抗血清與人肝臟微粒體蛋白在Mr約為46000處出現(xiàn)1條清晰帶, 與CYP3A4 Mr相符; 與多肽BSA在Mr約為69000

15、處出現(xiàn)1條清晰帶, 與BSA Mr相符; 而與BSA則無條帶出現(xiàn)（圖3）。說明所制備的抗體可識別含有半抗原的抗原表位的蛋白并能與天然CYP3A4蛋白結合。圖2圖3  略2.4  兔抗人CYP3A4多克隆抗體的免疫組化定位  CYP3A4主要分布在內質網和線粒體內膜, 而二者位于胞質中。經免疫組化實驗證明, CYP3A4多肽多克隆抗體可與正常人肝細胞胞質中的CYP3A4蛋白結合（圖4）。圖4  兔抗人CYP3A4多克隆抗體的免疫組化定位分析略3  討論國外Abcam、 Researchd、 Cypex公司已研制出用于ELISA、 Western

16、blot和免疫組化的抗CYP3A4抗體, 但上述公司抗體僅能應用部分試驗。而本實驗室的抗CYP3A4抗體可完全用于以上試驗。表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團, 找到一個抗原的表位, 就可能研制出針對該抗原的抗體或疫苗。結合現(xiàn)代生物信息學,用多參數(shù)的綜合預測抗原表位可以提高預測的準確性8。本實驗中進行蛋白質序列表位分析時, 著重考慮了以下幾個方面9: 親水性高。疏水性片段往往為跨膜成分或嵌入膜成分; 而親水性片段多暴露在脂質雙分子膜外, 容易形成抗原識別位點。表面可及性強。柔韌性好, 更易形成三維結構, 暴露抗原表位。連續(xù)性表位的氨基酸殘基數(shù)在1020之間為宜, 過短時不易形成明顯的

17、表位, 過長則合成時發(fā)生錯誤的機會增加。根據以上原因最終確定以親水性強、 抗原指數(shù)高、 表面性及柔韌性好的區(qū)域（即278-292位14個氨基酸）作為CYP3A4的抗原決定簇。雖然合成肽與載體蛋白（KLH）偶聯(lián)可增加免疫原性, 但也會產生一定的抗KLH的抗體10。所以, 在間接ELISA法中包被抗原用多肽BSA而不是多肽KLH, 以避免KLH的干擾。同樣原因, 在Western blot實驗中, 用多肽BSA和BSA各作抗原, 以避免KLH的干擾。本實驗中獲得的抗血清與人肝微粒體蛋白的免疫印跡分析結果顯示2條特異性條帶, 一條Mr是46000, 另一條大約是90000。我們認為90000的條帶可

18、能是CYP3A4的二聚體?？贵w的親和力是指抗體和抗原結合的牢固程度。多克隆血清是含有不同親和力抗體的復雜混合物, 因此, 多克隆血清的親和力不能精確測定下來, 但可制定其平均相對親和力11。根據文獻, 本實驗中相對親和力在105106 M-1, 對確定抗體的用途和驗證抗體的均一性等均有重要價值。總之, 我們以合成肽KLH為抗原免疫家兔制備了抗CYP3A4 pAb,Western blot 分析pAb 的特異性良好、 效價高, 為后續(xù)CYP3A4分子功能的研究和與藥物代謝的研制及應用提供了有用的工具。參考文獻:1 Lee JI, Chaves G, Amico JA, et al. Applic

19、ation of semisimuhaneous midazolam administration for hepatic and intestinal cytoehrome P450 3A  phenotypingJ. Phamacogene Genom, 2002, 72(6): 718-728.2 邱星輝, 冷欣夫. 細胞色素P450與癌癥因治療J. 生命的化學, 2000, 20(5): 238-239.3 柳曉泉, 王廣基, 錢之玉. 細胞色素P450 酶在藥物代謝及開發(fā)研究中的應用J. 藥學進展, 2000, 24（6）: 334-338.4 黃  永, 陳蘇民, 陳南春, 等. YggG截斷蛋白的表達及其抗體的制備J. 細胞與分子免疫學雜志, 2004, 20(2): 171-173.5 馬群風, 江