甲氨蝶呤中3種雜質的合成

1、甲氨蝶呤中3種雜質的合成鄭君軍1基金項目 國家“重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項（2009ZX09313）；衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目（200802038）作者簡介 鄭君軍，男，碩士研究生，研究方向為藥物合成。聯(lián)系電話E-mail：zhengjunjun。通訊作者 高烏恩，女，教授，研究方向為新藥研究與開發(fā)。聯(lián)系電話E-mail：gaowuen。吳松，男，研究員，研究方向為新藥研究與開發(fā)。聯(lián)系電話： （010）83163542，E-mail：ws。，王冬梅2，吳彩勝2，張金蘭2，高烏恩1*，吳 松2*（1 內蒙古醫(yī)學院，呼和浩特 010059；2 中國

2、醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050）摘要 目的:合成甲氨蝶呤原料藥中3種主要雜質。方法:以對甲氨基苯甲酸、2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽與1,1,3-三溴丙酮為原料，環(huán)化合成雜質E，再水解合成雜質D，甲氨蝶呤水解獲得雜質C。結果:所合成3種雜質的結構經氫譜（1H-NMR）和質譜（MS）確證，純度經HPLC檢測可達98.7%以上。結論:合成了甲氨蝶呤中的3種雜質，可作為甲氨蝶呤原料藥質量控制的雜質對照品。關鍵詞 甲氨蝶呤；抗腫瘤藥；雜質；合成中圖分類號 R914.5 文獻標志碼 A 文章編號 1003-3734Synthesis of three impurities of

3、 methotrexateZHENG Jun-jun1, WANG Dong-mei2, WU Cai-sheng2, ZHANG Jin-Lan2, GAO Wu-en1*, WU Song2*（1 Inner Mongolla Medical college, Hohhot 010059, China;2 Institute of Materia Mdica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Uion Medical College, Beijing 100050, China) Abstract Objective: To

4、 synthesize three impurities of methotrexate (impurity E, impurity D and impurity C). Methods: Use 4-(methylamino)benzoicacid, 2,4,5,6-tetraminopyrimidine sulfate and 1，1，3-tribromoacetone as starting materials to prepare impurity E and synthesize impurity D by hydrolyzing E, impurities C was obtain

5、ed by hydrolyzing methotrexate. Results: The structures of all impurities, whose purity were over 98.7% (detected by HPLC), were verified by 1H-NMR and MS. Conclusion: The synthetic compounds can be used as the reference substance of the impurities in the quality control of methotrexate.Key words me

6、thotrexate; antineoplastic drug; impurity; synthesis甲氨蝶呤(methotrexate，圖1)化學名為N-4-N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基甲基)甲基氨基苯甲酰-L-谷氨酸，臨床上用作抗腫瘤藥物和免疫抑制劑等，但可能發(fā)生多種不良反應，如胃腸道反應、肝腎功能損傷、肺炎或肺纖維化、骨髓抑制等，這些不良反應的產生，很可能與其含有的雜質有關。2007年7月上海華聯(lián)藥廠“甲氨蝶呤事故”引起了社會各界的廣泛關注1 ，因此，甲氨蝶呤雜質對照品對于甲氨蝶呤原料藥中雜質的準確定性和定量控制及保證甲氨蝶呤的藥品質量具有重要意義。圖1 甲氨蝶呤結構中國藥典201

7、0年版2只將甲氨蝶呤的異構體R-甲氨蝶呤作為雜質對照品收錄，我們在對甲氨蝶呤原料藥進行HPLC-MS分析時，發(fā)現其中還存在另外3種含量較多的雜質成分。參照歐洲藥典3，分別將這3種雜質命名為雜質E、雜質D和雜質C（圖2）。為進一步控制產品質量，為甲氨喋呤的質量控制提供雜質對照品的標準化合物，我們首次報道用化學方法合成上述3種雜質，以期解決甲氨蝶呤質量控制所需雜質對照品的來源問題。 圖2 雜質E、雜質D和雜質C的結構文獻報道的甲氨蝶呤合成方法可分為兩類4-10： 一鍋合成法，即對-甲氨基苯甲酰谷氨酸、四氨基嘧啶硫酸鹽或鹽酸鹽與1,1,3-三溴丙酮直接一步合成甲氨蝶呤。 分步合成法，先通過四氨基嘧啶

8、硫酸鹽或鹽酸鹽與1,3-二羥基丙酮或二溴丙醛或丙酮醛的反應獲得6-溴甲基-2,4-二氨基蝶啶，再與對甲氨基苯甲酰谷氨酸反應制得甲氨蝶呤。因此我們參照甲氨蝶呤的合成方法 10-13，設計以對甲氨基苯甲酸和2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽及1,1,3-三溴丙酮為原料，酸性條件下環(huán)合生成雜質E，再由雜質E水解合成雜質D；雜質C由甲氨蝶呤水解而得（合成路線見圖3）。圖3 甲氨蝶呤中雜質E、雜質D和雜質C的合成路線實驗部分1 儀器與試劑甲氨蝶呤、1,1,3-三溴丙酮、2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽（南京天尊澤眾化學有限公司）；對甲氨基苯甲酸(Alfa Aesar化學有限公司)；氫氧化鈉、乙醇、甲醇、丙

9、酮、濃鹽酸、濃硫酸、氨水、氯化鋅(北京化工廠，化學純)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(保定市高新區(qū)陽光科教儀器廠)；LABOROTA-4000型旋轉蒸發(fā)儀(德國HeidolAr公司)；核磁共振儀（Varian Mercury 300 MHz，DMSO溶劑）；LC/MSD TOF型液-質聯(lián)用儀（Agilent），熔點由 YRT 3熔點儀（天津大學精密儀器廠）測定，溫度未校正。2 實驗方法2.1 雜質E的制備 將甲氨基苯甲酸9.07 g（0.06 mol）置于500 mL的三頸瓶中，在攪拌的條件下加入100 mL氫氧化鈉的甲醇水溶液（氫氧化鈉2.40 g，0.06 mol；甲醇:水=1:

10、1），使對甲氨基苯甲酸充分溶解。待溶解后加入氯化鋅4.08 g（0.03 mol），即得白色懸濁液，制得鋅鹽直接用于下步反應。將2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽21.44 g (0.09 mol）加入上述鋅鹽三頸燒瓶中，加水66 mL，攪拌溶解，加熱到50，用濃鹽酸調節(jié)pH 至2。取30 mL 1,1,3-三溴丙酮(26.53 g, 0.09 mol）的乙醇溶液，滴加15 mL到反應液中，同時不斷加入20氫氧化鈉并保持pH為2，溫度保持在50。15 min后滴加剩余的1,1,3-三溴丙酮乙醇溶液，攪拌3.5 h。將反應液冷卻到3040，邊攪拌邊加入氨水(70 mL)，調節(jié)pH 至9.5，保持溫

11、度低于40，室溫攪拌15 min。加入硅藻土（10 g），攪拌15 min。過濾，水洗，棄去濾餅。室溫下濃鹽酸調節(jié)濾液的pH至6，有固體析出，過濾，水洗。將濾出物重新用水（100 mL）溶解，濃鹽酸調節(jié)pH 至1.5，繼續(xù)攪拌1.5 h，過濾析出固體物，水洗；按上述方法重新結晶1次。將結晶固體用少量水溶解，加20%氫氧化鈉調pH至10，攪拌下先加入少量丙酮，使形成懸液狀，再加入大量丙酮（300 mL）稀釋。室溫攪拌1 h，過濾，丙酮洗滌，減壓干燥，得黃色固體。將黃色固體溶于水（95 mL）中，用濃鹽酸調節(jié)pH 至4左右，有固體析出，過濾，依次用水，丙酮和乙醇洗滌，減壓干燥，得黃色固體雜質E（1

12、0.57 g， 36.14%），經HPLC測定，純度為98.7%，檢測條件同歐洲藥典3，mp 207209。1H-NMR（300 MHz, DMSO-d6） ：3.24 (s, 3H, N-CH3), 4.82 (s, 2H, CH2), 6.84 (d, J = 8.7, 2H, ArH), 6.98 (brs, 2H, NH2), 7.13 (s, 2H, NH2), 7.74 (d, J = 8.7, 2H, ArH) , 8.63 (s, 1H, ArH )。ESI-MS m/z: 326M+H +。2.2 雜質D的制備 將固體雜質 E（3.25 g，0.01 mol）置于500 mL

13、三頸瓶中，氮氣保護下，加入150 mL氫氧化鈉水溶液（1 mol·L -1）回流2 h后停止反應，用1 mol·L -1的鹽酸調pH至4.5，待析出固體，加入200 mL丙酮使其充分析出，過濾，水洗，得到淡黃色固體雜質D（3.20 g，98.2%），經HPLC測定，純度為98.8%，檢測條件同歐洲藥典， mp 226228。1H-NMR（300 MHz, DMSO-d6） ：3.18 (s, 3H, N-CH3), 4.78 (s, 2H, CH2), 6.77 (d, J = 8.1, 2H, ArH), 7.09 (brs, 2H, NH2), 7.71 (d, J =

14、 8.1, 2H, ArH), 8.48 (s, 1H, ArH ), 11.68 (s, 1H, OH), 12.15 (brs, 1H, CO2H)。ESI-MS m/z:327M+H +。2.3 雜質C的制備 將甲氨蝶呤（4.54 g，0.01 mol）置于500 mL三頸瓶中，氮氣保護下，加入150 mL氫氧化鈉水溶液（1 mol·L -1）回流0.5 h后停止反應，用1 mol·L -1的鹽酸調pH 至4.5，待析出固體，加入200 ml丙酮使其充分析出，過濾，水洗，得到淡黃色固體雜質C（4.50 g，99.1%），經HPLC測定，純度為98.7%，檢測條件同歐洲

15、藥典3，mp 223225。1H-NMR（300 MHz, DMSO-d6）：1.902.03 ( dd, J = 5.4, J = 7.2, 2H, CH2), 2.30 (t, J = 5.4, 2H, CH2), 3.18 (s, 3H, N-CH3), 4.224.36 (m, 1H, CH), 4.78 (s, 2H, CH2), 6.80 (d, J = 7.8, 2H, ArH), 6.90 (brs, 2H, NH2), 7.71 (d, J = 8.1, 2H, ArH), 8.20 (d, J = 6.9, 1H, NH), 8.48 (s, 1H, ArH), 11.59

16、(brs, 1H, OH), 12.28 (brs, 2H, 2×CO2H)。ESI-MS m/z:456M+H +,478M+Na +。討 論在合成雜質E時，pH對化合物的生成影響較大。研究發(fā)現，當pH低于或高于2時，都會影響雜質E的收率。據文獻報道14，在pH為2時，反應過程中的中間體6-溴甲基蝶呤（圖4）溶解性最好，而整個反應過程中有氫溴酸產生，將影響6-溴甲基蝶呤的溶解，進而影響產率，所以需嚴格控制pH值；同時，我們在雜質D和雜質C的后處理時發(fā)現，在調節(jié)pH值至4.5時，只形成了乳濁液，沒有得到固體，繼續(xù)降低pH值也不能形成固體，我們根據甲氨蝶呤的性質，選用丙酮使乳濁液固化，

17、最終得到了雜質D和雜質C的固體。圖4 6-溴甲基蝶呤研究中還發(fā)現，雜質C是甲氨蝶呤的降解產物，在生產、運輸過程都可能產生，尤其在制劑中其含量隨甲氨蝶呤儲存時間的延長而增高，是甲氨蝶呤中需重點關注的雜質。對合成出的3種雜質對照品進行了HPLC測定，按面積歸一化法計算均大于98.7%，可以作為甲氨蝶呤的雜質質量控制的對照品。參考文獻1 魏銘言.“甲氨蝶呤”事件經過 N.新京報，2007-12-13（A19）.2 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2010版（二部）M. 中國醫(yī)藥科技出版社，2010：149-150.3 European Pharmacopoeia Commission. The

18、European Pharmacopoeia 5.0 Edition M. The Stationery Office, 2005: 2011-2013.4 DORIS RS, DONNA BC, JAMES MS, et al. Analogs of Pteroylglutamic Acid. III. 4-Amino DerivativesJ. J Am Chem Soc, 1949, 71 (5): 1753- 1758.5 姚其正，張志祥，唐鋒等.抗腫瘤藥甲氨蝶呤衍生物及其在藥學上的用途:CN,1439641AP. 2003-09-03.6 劉毅,陳文政.甲氨蝶呤的合成工藝J.中國醫(yī)藥

19、工業(yè)雜志，1991，22(11)：520-523.7 ANDREW HT, MARY S, DIEM DC. Synthesis of multi-13C-enriched methotrexate for NMR studies of drug-enzyme interactionsJ. Heterocycles, 1987, 25(1): 507-514.8 JENSEN JK, ALSTER K. Method for preparing N-(4-(2,4-diamino-6-pteridinyl)-methyl) methyl-amino)benzoyl)glutamic acid:EP, 0048001P