幾種膠體金技術(shù)詳解

1、膠體金免疫分析技術(shù)詳解隨著免疫分析日益廣泛應(yīng)用于以臨床為主以及非臨床領(lǐng)域的診斷工業(yè)，免疫分析正在向兩個方向發(fā)展：一類為全自動化的免疫分析；另一類為以硝酸纖維膜為載體的快速免疫分析。前者需要價格昂貴的全自動儀器及與儀器嚴(yán)格配套的各種試劑盒，目前只能在醫(yī)療及檢測中心應(yīng)用，雖也能較快速給出結(jié)果，但仍需一定時間，不適合遠(yuǎn)離醫(yī)療及檢測中心的地區(qū)，更不能用于“患者床旁檢驗”和普查的需要，在酶免疫分析的基礎(chǔ)上，主要以硝酸纖維素膜為載體的快速診斷方法迅速和廣泛地發(fā)展起來。這類方法目前在文獻(xiàn)及市場上的命名還很不統(tǒng)一。它實際上屬于快速斑點免疫結(jié)合分析，主要有以下兩種方法：斑點免疫滲濾分析DIFA和斑點免疫層析分析

2、DICA。本篇主要介紹以金作為標(biāo)志物的膠體金免疫分析技術(shù)。金標(biāo)記免疫分析技術(shù)也稱免疫膠體金技術(shù)，是于1971年建立的一種信號顯示技術(shù)。此技術(shù)最初用于免疫電鏡檢查，由膠體金顆粒標(biāo)記抗原或抗體，與組織或細(xì)胞中相應(yīng)的抗體或抗原相結(jié)合，在電子顯微鏡的檢查時可起特異的示蹤作用。此后，此技術(shù)與銀染技術(shù)相結(jié)合建立的免疫金銀染色法，使抗原抗體特異反應(yīng)信號可在光學(xué)顯微鏡下觀察。近10多年來，利用硝酸纖維素膜（NC）等為固相載體，以膠體金標(biāo)記的抗原或抗體與特異配體的反應(yīng)在膜上進(jìn)行，建立了快速的金標(biāo)記免疫滲濾技術(shù)和金標(biāo)記免疫層析技術(shù)，并在傳染病、心血管病、風(fēng)濕病、自身免疫病的免疫學(xué)檢測中廣泛應(yīng)用。膠體金是指金微小粒

3、子（0-100nm）分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶膠，用此金溶膠標(biāo)記蛋白質(zhì)（抗原、抗體或SPA、SPG），膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的半定量或定性。與ELISA不同之處便是反應(yīng)時間大大縮短，僅需要數(shù)分鐘就完成了ELISA需數(shù)小時才能顯示的結(jié)果。因為在GIFA和GICA中，高濃度的抗體集中固定在纖維素的微孔中，待測抗原在滲濾或?qū)游鰰r，流經(jīng)微孔與固定的高濃度抗體緊密接觸，很快完成免疫結(jié)合反應(yīng)。這就是以膜

4、為基礎(chǔ)的膠體金快速免疫結(jié)合分析中的免疫濃縮作用。在ELISA中，待測抗原要在液相中經(jīng)過擴(kuò)散作用，逐漸與吸附在固相表面的抗體結(jié)合。同時，標(biāo)記抗體也需要同樣的擴(kuò)散結(jié)合過程形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，故需時間較長。故此技術(shù)做到了名副其實的POCT。原理：將氯金酸（HAuCl4）用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒（膠體金），標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗體，用于免疫印跡、免疫組織化學(xué)定位或快速免疫滲濾、免疫層析實驗。金標(biāo)記免疫滲濾技術(shù)的原理同一般的免疫斑點試驗，也是用已知抗原或抗體包被NC膜，再用金標(biāo)記抗體或抗原來進(jìn)行快速快速測定，陽性時斑點呈膠體金的紅色。改進(jìn)之處為采用了滲濾裝置，更加簡便

5、。金標(biāo)記免疫層析則是利用NC膜條狀纖維的毛細(xì)管作用，使樣品在涌動中與金標(biāo)記物及包被在NC膜上的抗原或抗體結(jié)合，出現(xiàn)呈色的陽性信號。膠體金的制備：在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界線十分清楚。金顆粒表面帶有大量負(fù)電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定的膠體，所以稱其為膠體金。膠體金的制作方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和鞣酸檸檬酸三鈉還原法。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例（即增加或減少還原劑的量）可得到所需不同直徑的金顆粒。但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，所以目前常用后兩種方法，以檸檬酸三鈉還原法為例。Frens標(biāo)準(zhǔn)方法：（1）取0、01%

6、HAuCl4溶液50mL,加熱煮沸，隨即快速加入1%檸檬酸三鈉溶液0.5mL.（2）約過25s沸騰的溶液變?yōu)榈{(lán)色，大約再過70s，藍(lán)色突然轉(zhuǎn)變?yōu)榱良t色，（3）繼續(xù)煮沸約5分鐘后結(jié)束反應(yīng)。（4）冷卻后用0.1MK2CO3溶液調(diào)至所需PH值。（5）此后再延長反應(yīng)時間或另加入額外的檸檬酸三鈉都不影響實驗結(jié)果。該法制備得到的金顆粒直徑約為41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金顆粒，該方法依然可行，唯一不同的是需要改變加入還原劑的量。另外，采用此標(biāo)準(zhǔn)方法所需反應(yīng)時間最短。附注：有研究者已經(jīng)注意到影響膠體金質(zhì)量及其穩(wěn)定性的幾種因素，制備過程中器具若全部使用干凈的玻璃器皿，溶液一律用0.2µ

7、m濾膜過濾后使用，水用玻璃三蒸水，推薦使用超純水，采取這些措施后制得的膠體金很穩(wěn)定。這些措施表明即使很微量的污物都會對膠體金制備帶來不良影響。雖然經(jīng)?？梢娡扑]使用硅化玻璃器皿的說法，其實使用普通玻璃器皿同樣也能制出高質(zhì)量高穩(wěn)定性的膠體金。免疫金的制備膠體金與抗原（或抗體）的結(jié)合物稱為免疫金或膠體金標(biāo)記物，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，又習(xí)慣稱之為金探針。膠體金標(biāo)記蛋白的原理是：在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)所帶正電荷基團(tuán)之間產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對所標(biāo)記蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響膠體金與抗原（抗體）吸附的主要因素，膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及

8、濃度等也影響蛋白質(zhì)的吸附。一般制備方法為：1、膠體金pH的調(diào)整（用K2CO3或HCL溶液調(diào)節(jié)pH至選定值。原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點，也可以略偏堿。但各標(biāo)記物的最適反應(yīng)pH往往需多次試驗才能確定）；2、蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定（將待標(biāo)記蛋白作一系列稀釋后各取一定量加入裝有一定量膠體金的試管中，然后分別加入NaCl溶液，混勻靜置數(shù)小時，對照管與加入蛋白量不足的管顏色會由紅變藍(lán)，而蛋白量足或超過的管保持紅色不變，其中含蛋白最低的一管即為穩(wěn)定膠體金所必須的最適標(biāo)記量。以此比例并增加10%-20%即為標(biāo)記全部膠體金溶液所需的蛋白總量）；3、標(biāo)記過程（在電磁攪拌棒下將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液

9、加于膠體金溶液中，反應(yīng)一定時間后加入BSA并調(diào)整至pH8.5，放置室溫繼續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘）；4、離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)（各粒徑的金粒子所需的離心轉(zhuǎn)速與時間均不一樣。離心后去上清液，將沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)至原體積后再離心。如此洗滌2-4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)）。NC膜硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，簡稱NC膜)，在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。國內(nèi)NC膜的分類主要有兩種：135s和180s。分類是依據(jù)現(xiàn)在大部分廠商用的4cm膜平均水的層析時間。換算為孔徑就是135s=8um，180s=6um。那么從這個公

10、式中可以看出，在通過同一長度位置時，金溶液通過的速度是快速膜>慢速膜。那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這里就有一個讀數(shù)時間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。綜合以上，結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會，也就是假陽性的升高。所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點至關(guān)重要。根據(jù)專家研究135s的一般用在雙抗體夾心法，180s的一

11、般用在競爭法。膠體金免疫分析技術(shù)1、 斑點金免疫滲濾試驗原理：膠體金免疫滲濾分析（DIGFA）原理與操作步驟基本與ELISA相同：加樣品于固定有配體（抗體或抗原）的硝酸纖維素膜上，通過滲濾在膜中形成抗體-抗原復(fù)合物，洗滌滲濾后，再加液體的膠體金標(biāo)記抗體。當(dāng)結(jié)果為陽性時，在膜上固定有抗體-抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物而呈現(xiàn)紅色斑點。技術(shù)類型：1、雙抗體夾心法用抗體結(jié)合在微孔膜中央，滴加待檢標(biāo)本，若標(biāo)本中待測抗原與膜上抗體上結(jié)合，然后滴加金標(biāo)抗體，再加洗滌劑洗滌后，陽性者即在膜中央呈紅色斑點（膠體金聚集）。2、間接法用抗原包被在微孔膜上，滴加待測標(biāo)本，滴加洗滌劑洗滌后，滴加金標(biāo)抗抗體，加洗滌劑洗滌后

12、，陽性者即在膜中央呈紅色斑點（膠體金聚集）。該法由于血清標(biāo)本中非目的性的IgG的干擾，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，臨床上運(yùn)用較少。裝置示意圖裝置分解圖2、 斑點金免疫層析試驗原理：斑點金免疫層析實驗（DICA）是膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合的以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。與膠體金免疫滲濾實驗的過濾性不同，DICA中滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體（或抗原）結(jié)合而被固化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實驗結(jié)果。技術(shù)類型：1、雙抗體夾心法如上圖所示，G處為金標(biāo)記抗體（免疫金

13、），T處為包被抗體，C處包被抗金標(biāo)抗體，B處為吸水紙。測試時A端滴加待測標(biāo)本，通過層析作用，待測標(biāo)本向B端移動，流經(jīng)G處時將金標(biāo)抗體復(fù)溶，若待檢標(biāo)本中含有待測抗原，即形成金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物，移至T區(qū)時形成金標(biāo)抗體-抗原-抗體復(fù)合物，金標(biāo)抗體被固定下來，在T區(qū)顯示紅色線條，呈陽性反應(yīng)，多余的金標(biāo)記抗體移至C區(qū)被抗金標(biāo)抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。2、 競爭法如上圖所示，G處為金標(biāo)抗體，T處包被標(biāo)準(zhǔn)抗原，C處包被抗抗體，測試時待測樣本加于A端，若待測標(biāo)本中含有待測抗原，流經(jīng)G處時結(jié)合金標(biāo)抗體，當(dāng)混合物移至T處，因無足夠游離的金標(biāo)抗體與膜上的標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合，T處無棕紅色線條出現(xiàn)，實驗結(jié)果為陽性，游離金

14、標(biāo)記或金標(biāo)記復(fù)合物流經(jīng)C處，與該處的抗金標(biāo)抗體結(jié)合出現(xiàn)棕紅色的質(zhì)控帶，若標(biāo)本中不含待測抗原，金標(biāo)抗體則于T處膜上的標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合，在T處出現(xiàn)棕紅色的線條，實驗結(jié)果為陰性。3、 間接法為了消除待測血清標(biāo)本中大量的非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)記抗人IgG，降低試驗敏感性，膠體金間接免疫層析法測抗體常設(shè)計成反流免疫層析法。測試卡可分為左右折疊的兩部分，右面中央縱向貼有NC膜條為膜上包被有抗原線T，E處為含能與蛋白結(jié)合的有色染料的樣本加樣區(qū)，F(xiàn)處為吸水材料；左面中央開有觀察窗口B，C處固定有金標(biāo)記羊抗人抗體，A、D處為吸水材料。測定時先將緩沖液加在D處層析至C處使金標(biāo)物復(fù)溶，然后將標(biāo)本加在E

15、處使其與染料一起在膜的層析作用下向F端移動，若標(biāo)本中有待測抗體存在，則于膜上抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，待有色染料延伸至膜上標(biāo)記線G處，在F處加緩沖液，合上測試卡，A的強(qiáng)大吸水作用使膜上液體反向移動，標(biāo)本中非特異性IgG及無關(guān)物被洗回E處，隨后而來的金標(biāo)羊抗人抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，出現(xiàn)棕紅色線條。無棕紅色線條出現(xiàn)則表明血清中無特異性抗體。該法有效的排除了非特異性抗體對測試的干擾。臨床應(yīng)用應(yīng)用范圍包括感染性疾病抗原、抗體檢測，如HBsAg、瘧原蟲抗原、TBAb、HPAb、HIVAb等；各種蛋白質(zhì)抗原檢測，如AFP、CEA、肌紅蛋白、肌鈣蛋白、尿微量白蛋白、OB等；激素檢測，如HCG、LH、F

16、SH、TSH等；藥物檢測，如嗎啡、可卡因等。適用范圍一般為定性試驗。樣本要求：樣本采集后應(yīng)盡快分離血清或血漿以避免溶血。檢測時應(yīng)盡量使用新鮮的樣本。樣本若不能及時送檢，可在2°-8°冷藏3天。長期保存需冷凍于-20°C，忌反復(fù)凍融。發(fā)臭、溶血、脂血、細(xì)菌污染等異常樣本請勿使用。注意事項：以GICA為例，它將幾種組分優(yōu)化組合成一個整體的免疫層析分析條，許多條件及條件的組合都會影響到它的質(zhì)量，包括：（1）硝酸纖維素膜的性能和質(zhì)量，膜孔徑大小及均一性，選定膜孔徑的適宜性，結(jié)合配體（抗原或抗體）容量的大小，非特異吸附性能，親水性及液體的流動性和流動速度的均一性等；（2）捕

17、捉配體的量及質(zhì)量（配體的純度，親和力及滴度）及在膜上配體的包被量和均一性。配體劃線位置的固定一致性；（3）固相金標(biāo)記膜中的膠體金和配體的含量和比度，條間的均一性，固相標(biāo)記物的穩(wěn)定性，復(fù)溶性，復(fù)溶速度及流動性，所含緩沖物質(zhì)的種類及有效促溶劑的使用等；（4）各種膜，甚至包括樣品墊是否經(jīng)過預(yù)期處理以減少非特異吸附。以上條件都可以綜合影響膠體免疫層析的質(zhì)量控制，主要包括：靈敏度，陰陽性界限值（cutoff）的準(zhǔn)確性和一致性及層析條間的重復(fù)性等。（1）靈敏度：因測定主要針對正常人體液中不存在或含量很低的生物活性物質(zhì)的定性結(jié)果。高靈敏度及其重復(fù)性是最重要的質(zhì)量控制指標(biāo)。為此，生產(chǎn)廠家在保證分析條的各種優(yōu)化

18、條件外，還應(yīng)提供能確證靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)品，供操作者檢驗其靈敏度和重復(fù)性。另外，還應(yīng)配有相應(yīng)的陽性及陰性對照血清以供對照之用。（2）陰陽性界限值的準(zhǔn)確性和重復(fù)性：避免發(fā)生假陰性或假陽性的結(jié)果，保證結(jié)果的正確。生產(chǎn)廠家應(yīng)提供確定界限值的標(biāo)準(zhǔn)品，最好還要提供低于或高于界限值的標(biāo)準(zhǔn)品（注明濃度），以供使用者對結(jié)果的判斷。所有試劑板均應(yīng)于干燥環(huán)境下恢復(fù)至室溫再拆封使用。應(yīng)用的重點和展望臨床應(yīng)用的重點應(yīng)放在：急需快速診斷以便進(jìn)行治療的急重癥，如協(xié)助確診急性心肌梗死的急性心梗標(biāo)志物就是很好的例子。有普查意義的檢查和流行病學(xué)調(diào)查：如各種傳染?。ú《拘愿窝?，艾滋病，性病及其它各種流行?。┝餍胁≌{(diào)查；某些腫瘤（如前列腺癌，結(jié)腸癌，肝癌，乳腺癌）的普查及預(yù)防檢查；圍產(chǎn)期的健康普查等。它可以作為快速的初篩普查手段，對陽性和可疑的結(jié)果再進(jìn)一步做更細(xì)的可靠的檢查。今后的發(fā)展：（1）全面提高質(zhì)量。突出質(zhì)量控制的保證，為進(jìn)一步發(fā)展打好基礎(chǔ)。（2）提高檢測的靈敏度。目前檢測的靈敏度都低于相應(yīng)的定量免疫分析，應(yīng)盡量縮小差距。除使用各種優(yōu)質(zhì)的原料，如膜條，高純度高親和力的