垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽對大鼠腦缺血再灌注后誘導(dǎo)性一氧化氮合酶表達的影響

1、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽對大鼠腦缺血再灌注后誘導(dǎo)性一氧化氮合酶表達的影響         11-06-05 16:20:00     作者：路文革 白宏英    編輯：studa20【摘要】  目的 探討大鼠局灶性腦缺血再灌注時氧化氮合酶（iNOS）在PACAP腦保護機制中的作用。方法 采用大腦中動脈線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型，對36只大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和PACAP組，在大鼠腦缺血2h后進行24h、48h再

2、灌注，應(yīng)用免疫組化法檢測腦組織iNOS的表達。結(jié)果 腦缺血再灌注后，與假手術(shù)組比較，iNOS的表達量顯著增加，陽性細胞數(shù)分別為60.02±4.23、80.36±6.24，P<0.01；應(yīng)用PACAP后與缺血再灌注組比較，iNOS表達的峰值明顯降低，分別為30.47±5.24、40.56±4.84，P<0.01。結(jié)論 PACAP能抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注時iNOS的表達，這可能是其腦保護作用之一。 【關(guān)鍵詞】  PACAP；腦缺血再灌注；iNOS       &#

3、160;  Effect of PACAP on the expression of iNOS in rats during transient focal cerebral ischemiareperfusion  Lu Wenge,Bai Hongying.The First Peoples Hospital of Shangqiu City,Shangqiu 476000,China 【Abstract】  Objective  To investigate the effect of PACAP on the activation an

4、d the expression of iNOS in cerebral cortex during transient focal cerebral ischemiareperfusion, and to discuss the probable mechanism of its protective effect.Methods  Thirtysix SD rats were randomly divided into 3 equal groups: sham operation group undergoing sham operation; ischemia/reperfus

5、ion(I/R) group undergoing thread embolism of the left middle cerebral artery occlusion(MCAO) to cause focal ischemia for 2 hours and then undergoing reperfusion; and PACAP group undergoing peritoneal injection of PACAP half hour after the ischemiareperfusion of MCAO.  Then the rats in the 3 gro

6、ups were redevided into subgroups of 6 rats, to be decapitated 24，48 hours after reperfusion for the later two groups, and their brains were taken out and fixed.  Immunohistochemistry was used to detect the expression of iNOS in the brain.Results  The expression values of iNOS in the ische

7、mic cortexes were significantly higher than those in the cortex of the sham operation group(P<0.01)，and were all significantly lower in PACAP group than those in the I/R group(all P<0.01).Conclusion  PACAP inhibits the activation and the expression of iNOS during focal ischemiareperfusion

8、 which may be one of the mechanisms of its neuroprotective function.    【Key words】  PACAP；Ischemiareperfusion；iNOS        研究表明,在腦缺血再灌注損傷過程中,NO的生成是重要的發(fā)病環(huán)節(jié),引起細胞死亡或凋亡。NOS活性間接反映NO的生成能力。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（PACAP）具有神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護作用。其能否抑制缺血再灌注后iNOS的表達，目前國內(nèi)外尚無動物試驗的

9、文獻報道。為此，本研究建立大鼠腦缺血再灌注模型，探討iNOS在PACAP 腦保護機制中的作用。1  材料與方法1.1  實驗動物及分組  健康SD大鼠36只，體質(zhì)量（300±20）g，采用隨即數(shù)值表分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、PACAP組，每組12只。各組根據(jù)不同時間點又分為缺血2h 再灌注24h、48h組，每小組各6只大鼠。1.2  局灶性腦缺血再灌注模型的制作  用Koizumi線栓法1，建立大鼠局灶性腦缺血模型。以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥固定，分離并暴露左側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動脈。結(jié)扎翼腭動脈，將栓

10、線從頸外動脈至頸內(nèi)動脈，插入左側(cè)大腦中動脈（MCA），遇阻即止，線栓前端頸內(nèi)動脈起始處約（18.5±1.0）mm，阻斷該側(cè)MCA的血流供應(yīng)。假手術(shù)組線栓深度為10mm。模型成功的大鼠在缺血2h后拔線至頸外動脈殘端內(nèi)進行再灌注。PACAP組于再灌注30min內(nèi)，由微動脈注射，1×109mol/kg，1次/d。假手術(shù)組和腦缺血再灌注組，用等體積NS代替PACAP。1.3  腦組織石蠟切片的制備  各組大鼠分別于再灌注12、24h用10%水合氯醛過量麻醉，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室主動脈插管，先快速灌注37NS，隨后灌注4%的多聚甲醛固定液0.01ml/l,開顱取

11、腦，于視交叉前后2mm處，將腦連續(xù)冠狀切片，厚度為4mm,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切成3m厚的連續(xù)冠狀石蠟切片。1.4  免疫組織化學染色  一抗iNOS購自北京中衫生物試劑公司，PACAP購自美國Sigma公司。3、3二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自北京中衫公司。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、滴加一抗體后，按試劑盒說明書常規(guī)SP法對切片標本進行染色、DAB顯色、蒸餾水洗、脫水、透明、封片。陽性染色為胞漿棕色顆粒。陰性對照以PBS代替一抗，余步驟同上。1.5  參考Longa  5分制評分標準2對其進行首次神經(jīng)功能評分:0分,無神經(jīng)損傷癥狀;1分,不能完全伸展

12、對側(cè)前爪;2分,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向?qū)?cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。此后分別對各組大鼠再灌注后24h、48h進行評分。Longa評分為13分認為模型制作成功，評分為0分或4分則排除該標本。1.6  圖象分析和統(tǒng)計學處理  切片在顯微鏡下放大400倍，隨機選擇6個不重疊的視野，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)量，測得的數(shù)據(jù)用表示。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，差異顯著性檢驗采用t檢驗。以=0.05作為顯著性檢驗標準。2  結(jié)果2.1  腦組織切片HE染色  假手術(shù)組大鼠大腦外觀正常，無腫脹，表面血管清晰可見；缺血再灌注組大鼠缺血側(cè)大腦半球與對側(cè)相比腫脹明

13、顯，MCA供血區(qū)蒼白，無光澤，表面血管消失。腦組織切片顯示：假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)無明顯異常；缺血再灌注組可見大量變性及壞死的神經(jīng)細胞，少量膠質(zhì)細胞，灶周有膠質(zhì)細胞、炎性細胞；且隨再灌注時間的延長而加重；PACAP組皮層缺血中心范圍較小，病變較缺血再灌注組明顯減輕。2.2  iNOS的表達結(jié)果  在假手術(shù)組和非缺血側(cè)大腦半球內(nèi)iNOS不表達。缺血再灌注組缺血側(cè)半球大腦皮質(zhì)內(nèi)有明顯的表達。iNOS陽性細胞于再灌注24h顯著增多，再灌注48h增多非常顯著。PACAP組與缺血再灌注組比較，各時間點的表達量均顯著減少（P<0.01）。見表1。表1  3組大鼠大腦缺血皮質(zhì)

14、內(nèi)iNOS的表達結(jié)果（略）與缺血再灌注組比較P<0.013  討論    近年來,大量的實驗研究發(fā)現(xiàn), 腦缺血再灌注損傷過程中,一氧化氮(NO)生成增多,尤其是再灌注過程中產(chǎn)生的NO可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)毒作用,在缺血性腦損傷中起重要作用。在腦缺血再灌注損傷中,NO既有擴張血管,改善缺血組織血供,抑制血小板凝集,減輕缺血及再灌注損傷的作用3，又有介導(dǎo)和加重缺血及再灌注損傷的毒性作用。其中NO的濃度、產(chǎn)生部位、作用部位、產(chǎn)生時間等的不同以及NO氧化、還原狀態(tài)決定了NO在腦缺血及灌注中的作用。適當濃度的NO對腦血流調(diào)節(jié)有十分重要的作用,對神經(jīng)元具有保護作用,而過多的NO釋放則表現(xiàn)出毒性作用,加重了腦缺血后的損傷程度。NO引起的毒性作用涉及到以下幾個方面:(1)興奮性氨基酸的過度釋放、細胞內(nèi)外鈣平衡紊亂是缺血性腦損傷重要的病理生理過程,而NO可介導(dǎo)谷氨酸通過NMDA受體的過度興奮引起NMDA受體依賴性鈣通道開放,胞外鈣離子大量內(nèi)流,Ca2+或鈣調(diào)蛋白可激活蛋白酶、磷脂酶、NOS、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶等,一系列的反應(yīng)將導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化、自由基生成增加、膜通透性增強，最終導(dǎo)致細胞死亡。(2)通過鐵蛋白產(chǎn)生毒性作用3。高濃度