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1、熒光分光光度法測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量姓名:周蘊(yùn)赟 學(xué)號(hào):40507026(2005級(jí)4班 Email : zyy1021) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)熒光分光光度法測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理;2、掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理:常溫下,處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見(jiàn)光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子,激發(fā)態(tài)分子通過(guò)無(wú)輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí),再以輻射躍遷的形式回到基態(tài),發(fā)出比吸收光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中,熒光強(qiáng)度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系:當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí),熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系:這是熒光光
2、譜法定量分析的理論依據(jù)。熒光分析法的特點(diǎn):a. 與紫外-可見(jiàn)分光度法比較,熒光分析法具有更高的靈敏度。b. 選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜,又能依據(jù)吸收光譜來(lái)鑒定物質(zhì)。c. 所需試樣量少、操作方法簡(jiǎn)便。熒光光譜激發(fā)光譜:固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處,處于激發(fā)態(tài)的分子最多,熒光強(qiáng)度最大。發(fā)射光譜:固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。固定發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)光波長(zhǎng)掃描,找出最大激發(fā)光波長(zhǎng),然后固定激發(fā)光波長(zhǎng)進(jìn)行熒光發(fā)射波長(zhǎng)掃描,找出最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射熒光波長(zhǎng)的選擇是本實(shí)驗(yàn)的
3、關(guān)鍵。熒光分析儀器常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示記錄器五部分構(gòu)成,如下圖所示:液槽顯示器單色器檢測(cè)器I0IIf光源單色器維生素B2(又叫核黃素,VB2)是橘黃色無(wú)臭的針狀結(jié)晶,其結(jié)構(gòu)式為: 維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑,在中性或酸性溶液中穩(wěn)定,光照易分解,對(duì)熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430440 nm藍(lán)光的照射下,發(fā)出綠色熒光,熒光峰在535 nm。維生素B2在pH=67的溶液中熒光強(qiáng)度最大,在pH=11的堿性溶液中熒光消失,所以可以用熒光光度法測(cè)維生素B2的含量。多維葡萄糖中含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖,其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光,維
4、生素B1本身無(wú)熒光,在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光,維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光,他們都不干擾維生素B2的測(cè)定。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素,光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多,故測(cè)維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi),且在避光條件下進(jìn)行。三、試劑與儀器:970CRT熒光光度計(jì)5 ml吸量管1只,2 ml吸量管1只, 50 ml容量瓶6只, 100 ml容量瓶1只2標(biāo)準(zhǔn)溶液,冰乙酸, 多維葡萄糖粉試樣。四、實(shí)驗(yàn)步驟:(一)、970CRT熒光光度計(jì)基本操作:1. 打開(kāi)氙燈,再打開(kāi)主機(jī),然后打開(kāi)計(jì)算機(jī)啟動(dòng)工作站并初始化儀器,預(yù)熱30min。2. 儀器初始
5、化完畢后,在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目,設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù):設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為440nm,發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm,靈敏度2,入射縫寬和出射縫寬均為10nm。4. 樣品測(cè)定1)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測(cè)定: 在62ug/ml的維生素B2溶液,從稀到濃測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2)未知試樣的測(cè)定:稱取378g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中,加2.00 ml冰乙酸,稀釋至刻度,搖勻。用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件,平行測(cè)量其熒光強(qiáng)度3次。5、退出主程序,關(guān)閉計(jì)算機(jī),先關(guān)主機(jī),最后關(guān)氙燈。五、數(shù)據(jù)處理:1. 用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制
6、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度(g/ml)熒光強(qiáng)度(I)123平均4.323 4.307 4.298 4.309 7.380 7.329 7.340 7.350 9.840 9.801 9.790 9.810 12.020 12.033 11.976 12.010 14.678 14.781 14.744 14.734 17.088 17.091 17.090 17.090 2、未知樣品濃度的測(cè)定 根據(jù)待測(cè)液的熒光強(qiáng)度
7、,從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度,計(jì)算出試樣中含量。編號(hào)123平均值Il-10.2030.2010.203維生素B2百分含量= (0.203×50×10-6)/0.1378×100=0.0074六、注意事項(xiàng)1.使用970CRT時(shí),要按照儀器使用規(guī)定使用,不可隨意操作。2.使用石英比色皿時(shí),要注意勿用手直接觸摸比色皿表面,因握住惻棱。七、思考題:1. 試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因?答:熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比,提高激發(fā)光強(qiáng)度,可成倍提高熒光強(qiáng)度。同時(shí),提高儀器靈敏度,也可提高熒光光度法的靈敏度。而對(duì)于吸收光度法,無(wú)論是提高激發(fā)光強(qiáng)度提高儀器靈敏度還是提高儀器靈敏度,入射光和出射光同時(shí)增大,其靈敏度不變。因此,熒光光度法較吸收光度法靈敏度高。2
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