Ti-75合金對人成骨細胞的生長、增殖和功能分化的影響

1、    Ti-75合金對人成骨細胞的生長、增殖和功能分化的影響        摘要：目的：研究Ti-75合金對人成骨細胞生長、增殖和功能分化的影響。方法：將傳至第5代的人成骨細胞接種于Ti-75合金表面進行培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時間進行細胞計數(shù)，計算細胞貼壁率，繪制細胞生長曲線，檢測細胞裂解產(chǎn)物中的堿性磷酸酶(ALPase)活性和蛋白質(zhì)含量。結(jié)果：培養(yǎng)于Ti-75合金表面的人成骨細胞在24 h貼壁率達到84.38%，細胞ALPase活性和蛋白質(zhì)合成量在培養(yǎng)第7天后出現(xiàn)明顯增大趨勢,

2、各項指標同作為對照組的純鈦相比，均無顯著差異。結(jié)論：Ti-75合金具有與純鈦相同的良好骨組織生物相容性，適于作為骨內(nèi)種植材料應用。關(guān)鍵詞：種植材料；成骨細胞；細胞培養(yǎng)分類號：R783.1文獻標識碼：A文章編號：1001-3733(2000)01-0024-03Experimental research on the osteoblasts function on Ti-75 alloyZhang ChunbaoChen FulinZhang Ronget al. (School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xian

3、 710032)Abstract：Objective：To study the human osteoblasts function on Ti-75 alloy surface. Method: Human osteoblast of passage five were seeded onto Ti-75 alloy and Titanium surface, cell attachment efficiency was calculated, cell growth curve was drawn, and ALPase activity and protein content were

4、measured at different intervals after seeding.Results: cell attachment efficiency on Ti-75 alloy surface reached 84.38% 24 hours after seeding. ALPase activity and protein content increased significantly 7 days after seeding. There were no significant differences between the human osteoblasts functi

5、on on the surface of Ti-75 alloy and Titanium. Conclusion: Ti-75 alloy had good bio compatibility just as Titanium and was suitable to be used as the biomaterials for dental implant。Key words：Implants materials;Osteoblasts;Cell cultivation在生物材料領(lǐng)域中,鈦及鈦合金以杰出的生物相容性和良好的耐腐蝕性等優(yōu)點,占據(jù)了非常重要的地位。Ti-75合金是中國西北有色金

6、屬研究院近年研制出的一種新型鈦合金,其強度介于純鈦和Ti-6Al-4V之間,不含釩,機加工性能優(yōu)于純鈦，是作為骨內(nèi)種植的良好備選材料。近年來,由于細胞培養(yǎng)和分化提純技術(shù)的研究進展,為觀察骨細胞和生物材料的相互作用提供了一個有效的手段1，應用細胞培養(yǎng)的方法,建立骨一種植體界面的體外模型,對成骨細胞在種植材料表面的吸附、分化等表達特點進行研究,使在細胞和分子水平上研究生物材料與生物組織的相互作用成為可能。本研究即是采用上述方法，研究Ti-75合金對人成骨細胞的生長和功能分化的影響，以評價Ti-75合金作為骨內(nèi)種植材料應具有的骨組織生物相容性2。1材料和方法1.1實驗材料 Ti-75合金、TA2純鈦

7、(西北有色金屬研究院提供)；人成骨細胞（本院中心實驗室提供）等。1.2實驗方法1.2.1試件處理Ti-75合金及TA2加工成直徑15 mm,厚1 mm的圓片試件，經(jīng)噴砂、清洗后，高溫高壓消毒,分別置于經(jīng)放射線消毒的24孔細胞培養(yǎng)板中。整個操作過程中均以鈦鉗夾持試件,防止異種元素污染。1.2.2成骨細胞貼壁率的測定 d=15 mm的Ti-75和TA2試件分別放于24孔培養(yǎng)板中,接種傳至第5代的人成骨細胞,接種密度: 4×104個/ml，每孔加入0.5 ml。DMEM培養(yǎng)液中含有體積分數(shù)()為10%胎牛血清、50 g/ml L抗壞血酸。放入二氧化碳培養(yǎng)箱37 ,飽和濕度,(CO2)=5%

8、培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 1、2、8、24 h后各取出3個孔,去除細胞培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS清洗3次，2.5 g/L胰酶0.25 ml /孔消化3 min，加0.25 ml細胞培養(yǎng)液中和胰酶,細胞計數(shù)板計數(shù)細胞,每孔重復4次,取平均值。貼壁率計算公式為:貼壁細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。1.3成骨細胞生長曲線的測定d=15 mm的 Ti-75和TA2試件放于 24孔培養(yǎng)板中,接種傳至第5代的人成骨細胞,接種密度:2×104個/ml，每孔加入0.5 ml，培養(yǎng)液同前。分別于1、4、7、10 d各取出 4個孔,進行細胞計數(shù),繪制生長曲線。1.4成骨細胞功能、分化指標檢測。

9、細胞培養(yǎng)方法同1.3，接種后第1天始,每3 d換液一次,取4、7、10、14 d4個點進行培養(yǎng),每時間點4個孔，用于制備細胞裂解液。制備細胞裂解產(chǎn)物: 吸去培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS清洗細胞3次,細胞裂解液(體積分數(shù)為0.02%Triton X-100,0.3 mmol/L PBS, pH7.27.4)200 l，4 下放置24 h。1.4.1細胞層堿性磷酸酶(ALPase)活性測定 細胞裂解產(chǎn)物100 l加入反應底物(對硝基苯磷酸鹽PNPP，Mg2+) 150 l， 37 孵育30 min,加入0.4 mol/L NaOH 100 l終止反應,酶聯(lián)免疫儀檢測吸光度值,波長為410

10、nm。1.4.2細胞層蛋白質(zhì)含量測定 細胞裂解產(chǎn)物20 l加顯色液(50 g/L考馬斯亮藍 G250、(乙醇)=2.375%、42.5 g/LH2PO4)200 l，混合均勻10 min，酶聯(lián)免疫儀測定吸光度值,波長為595 nm。2結(jié)果2.1Ti-75合金表面成骨細胞貼壁率的測定接種于Ti-75合金表面的人成骨細胞在前2 h的貼壁率為45.31%，到 24 h貼壁率達到84.38%(1)。與TA2相比，在各個培養(yǎng)時間的細胞貼壁率二者無明顯差異。2.2細胞生長曲線Ti-75與TA2表現(xiàn)出近乎相同的生長特點,培養(yǎng)第1天,細胞數(shù)為1.51×104,至第7天,細胞增長為3.31×

11、104個,第 10 d時,細胞數(shù)達到8.23×104個。(2)。2.3細胞的功能分化指標細胞 ALPase活性和蛋白質(zhì)合成量由吸光度值表示。從3、4可看出,上述指標在培養(yǎng)第7天后出現(xiàn)明顯增大趨勢。1 不同培養(yǎng)時間Ti-75和TA2表面成骨細胞的貼壁率培養(yǎng)時間2 Ti-75及TA2表面人成骨細胞生長曲線培養(yǎng)時間3 Ti-75及TA2表面細胞層ALPase活性培養(yǎng)時間4 Ti-75及TA2表面細胞層蛋白質(zhì)含量3討論3.1種植體骨界面的愈合機制對于骨內(nèi)種植生物材料,除要求其滿足基本的生物相容性要求之外,還應具有利于種植體骨界面骨性愈合的性質(zhì),即骨組織生物相容性2。種植材料與骨組織的相互作用

12、即種植體骨界面的愈合機制對種植材料的性能以及種植體的預后有著極其重要的意義。對于骨內(nèi)種植材料的骨組織生物相容性研究,是將骨組織對材料的反應作為研究重點,側(cè)重的是研究生物材料對骨愈合過程的能動性影響。關(guān)于種植體植入骨內(nèi)后的種植體骨界面愈合機制,人們普遍認為是通過種植體表面與周圍組織在分子及細胞水平上的相互作用而完成的。種植體植入骨內(nèi)后,很快的吸附周圍血液、組織液中的生物大分子,如:纖維粘連蛋白,骨粘連蛋白,纖維蛋白原以及各種細胞因子(如骨形成蛋白,-轉(zhuǎn)化生長因子等),形成生物大分子層, 從而引起一系列的細胞學變化：細胞轉(zhuǎn)化因子引導未分化間充質(zhì)細胞、骨母細胞、成骨細胞向種植體表面移行，通過細胞粘連

13、因子而發(fā)生貼壁,在細胞生長因子的作用下出現(xiàn)增殖或分化等不同的反應3。種植體表面的細胞層增殖、分化、合成并分泌細胞外基質(zhì),礦化成骨。種植材料表面的理化性質(zhì)能影響生物大分子層的結(jié)構(gòu)、組成和空間構(gòu)象，進而導致不同的細胞學表現(xiàn)。因此,骨內(nèi)種植材料表面選擇性吸附生物大分子是它影響整個界面骨愈合過程的中間環(huán)節(jié)。這一影響可通過細胞學的反應表現(xiàn)出來。成骨細胞在生物材料表面的貼壁率、生長曲線、細胞層堿性磷酸酶活性和蛋白質(zhì)含量等指標可反應細胞的生長與功能分化兩方面的特性,從組織愈合的一般特性到骨愈合的特殊性兩方面較全面的反應骨內(nèi)種植材料促進界面骨性愈合的能力,從而可作為體外評價骨內(nèi)種植材料骨性生物相容性的有效指標

14、。3.2Ti-75合金的骨組織相容性評價純鈦表面的惰性氧化膜使其具有比較理想的骨組織生物相容性,在骨內(nèi)種植材料中占據(jù)了顯著的地位。然而，純鈦的力學性能仍顯得相對偏弱，Ti-6AL-4V合金雖然具有較高的力學性能,但由于它含有釩、鋁等有害成分,其應用前景尚存在爭議。Ti-75合金的抗拉強度和屈服強度分別為790和630 MPa,力學性能介于Ti-6AL-4V和純鈦之間，且其韌性高于Ti-6AL-4V，不含釩,含鋁量也很低。裘松波4采用體外成纖維細胞培養(yǎng)法對Ti-75合金的細胞毒性和耐腐蝕性進行的實驗研究表明:Ti-75合金具有良好的生物相容性和耐腐蝕性,是作為骨內(nèi)種植體較為理想的候選材料，因而對

15、Ti-75合金的骨組織生物相容性的評價則顯示出很大的必要性。從本實驗結(jié)果可以看出：在相同的接種密度和培養(yǎng)條件下,在Ti-75和純鈦表面培養(yǎng)的成骨細胞貼壁率、細胞生長曲線幾乎重疊,形狀接近“S”形,因而可認為Ti-75與純鈦在對細胞生長的影響上具有相同的作用。同樣,從細胞層ALPase活性和蛋白質(zhì)含量等細胞功能分化的指標也可看出,在Ti-75和純鈦上培養(yǎng)的人成骨細胞的上述各項指標隨培養(yǎng)時間變化的曲線也近乎重疊。實驗結(jié)果表明： Ti-75合金的骨組織生物相容性的各項指標與純鈦均無顯著差異，可以認為， Ti-75具有與純鈦一樣良好的骨組織生物相容性，結(jié)合其良好的機械力學性能,可看出 Ti-75合金在

16、骨內(nèi)種植材料的應用中將具有良好的前景?；痦椖浚簢易匀豢茖W基金資助項目，批準號39700164，39470759作者單位：張春寶(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 710032)陳富林(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 710032)張蓉(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 710032)馬軒祥(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 710032)宋應亮(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院 710032)參考文獻：1Itakura Y,Kosugi A,Sudo H,et al.Development of a new sysfem for evaluaing the biocompatibility of implants materials using an osteogene cell line.J Biomed Mater Res,1988,22:6132李德華. 鈦種植