高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、2.目的：建立高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 范圍：適用于原輔、成品的高效液相色譜法檢測(cè)。 責(zé)任人；QC負(fù)責(zé)實(shí)施，QC主管負(fù)責(zé)監(jiān)督。程序：檢驗(yàn)依據(jù)中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄P28 檢驗(yàn)規(guī)程題 U高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編碼SOP-ZL-QC-002-00制訂人日期審核人日期批準(zhǔn)人日期頒發(fā)部門(mén)頒發(fā)日期分發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部生效日期變更記載：申請(qǐng)日期：批準(zhǔn)日期：變更摘要：3.4.4.14.24. 2.2對(duì)儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀，儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān) 規(guī)定4. 2. 2.1色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填 充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠

2、最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類(lèi)型的硅烷鍵合硅 膠（如St基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充常 用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填 充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對(duì)映異構(gòu)體的拆分分析。填充柱的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳 量和鍵合類(lèi)型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測(cè)物的保留行為和分離效果?？讖皆?15nin以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng) 選擇孔徑在30nin以上的填料。以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用PH28的流

3、動(dòng)相。當(dāng)PH大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)PH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用PH大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采 用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機(jī)一無(wú)機(jī)朵 化填充劑或非硅膠填充劑等，當(dāng)需使用PH小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑， 如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷 、鍵合硅膠、有機(jī)一無(wú)機(jī)雜化填充劑等。4. 2. 2. 2檢測(cè)器 最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有二極管陣列檢測(cè)器 (DAD)、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè) n

4、o d*- 祜寸0紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與待測(cè)溶 液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型 檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，其響應(yīng)值 兒乎僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄待測(cè)物在規(guī)定波長(zhǎng)范ffl內(nèi) 的吸收光譜，故可用于待測(cè)物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢査。紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度在一定范ffl內(nèi)呈 線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度通常并不呈線性關(guān)系，必要時(shí) 需對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的

5、要求不同。如采用紫外檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)至少符合 紫外一可見(jiàn)分光光度法項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)器時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有 機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常 不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動(dòng)相。4. 2. 2. 3流動(dòng)相由于G鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合 硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%,否則G鏈 的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類(lèi)型不得改變外，其余 如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組

6、成的比例、 柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng) 適用性試驗(yàn)的要求。但對(duì)某些品種，必須用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求者，可 在該品種項(xiàng)下注明。4. 2. 3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)指 標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中更具實(shí)用意義的參數(shù)。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn) 行試驗(yàn)，應(yīng)符合要求。如達(dá)不到要求，可對(duì)色譜分離條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。4. 2. 3.1色譜柱的理論板數(shù)（n）在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下 規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜

7、圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間ta（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬（耳，），按n=5.54 tn “（嘰匕計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。4. 2. 3. 2分離度（R） 無(wú)論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰 或特定的雜質(zhì)對(duì)照峰之間有較好的分離度。分離度的計(jì)算公式為：2 （ti； txi）R=W,+W：式中ta：為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；切為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；%和Wc為此相鄰兩峰的峰寬。除另有規(guī)定外，定量分析時(shí)分離度應(yīng)大于1.5。4. 2. 3. 3 ®復(fù)性 取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積 測(cè)量值的

8、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于 80%、100%和120%的對(duì)照品品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液, 分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%4. 2. 3. 4拖尾因子（T）為保證分離效果和測(cè)量精度，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符 合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。拖尾因子計(jì)算公式為：Wo, 05hT=2d：其中：Wo皿為5%峰高處的峰寬；di為峰頂點(diǎn)至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量時(shí)T應(yīng)在0.951.05之間。峰面積法測(cè)定時(shí)，T值偏 離過(guò)大，也會(huì)影響小峰的檢測(cè)和定量的旌確度。4. 2.4測(cè)定法4. 2.4.1

9、內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱(chēng)（量）取對(duì)照品和和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精 密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測(cè) 量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：As/csAr/Cr式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高;校正因子f=Ar為對(duì)照品的峰面積或峰；Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液的濃度：G為對(duì)照品溶液的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供 試品中待測(cè)成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax含量（CX）=fX : A s/c S式中 Ax為供試品（或雜質(zhì)）

10、的峰面積或峰高:CX為供試品（或雜質(zhì)）溶液的濃度；A S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高：C S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為校正因子。當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，使用等量同一濃 度的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，CS二C S,則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱(chēng)（量）取。Ax4. 2. 4. 2外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)朵質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱(chēng)（量） 取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì) 照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：含量（CX）=5 Ar式中各符號(hào)意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品

11、中某雜質(zhì)或主成 分含量時(shí)，以定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。4. 2. 4. 3加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定朵質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按 各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱(chēng)（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜 質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正 W子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)， 通常以主成分為參照采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。測(cè)定朵質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限 度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度（以噪聲

12、水平可接受為限）或進(jìn)樣 量（以柱子不過(guò)載為限），使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%25%或 其峰面積能準(zhǔn)確積分通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD ）應(yīng)小 于10%：含量在0. 5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面 積的RSD應(yīng)小于2%。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣。供試品溶液 的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜 圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依 法訃算各雜質(zhì)含量。4. 2. 4. 4不加校正因子的主成分自身對(duì)照法當(dāng)沒(méi)有雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)，也可采用不加校正W子的主成分自身對(duì)照法。同上述（3）法配 制對(duì)照溶液并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記 錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上 過(guò)雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖1, 再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖2。色譜圖1上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜 圖2上的溶劑峰面積，