血紅雞爪槭葉片總RNA提取方法的比較研究

1、中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2011,27(02):7-11ChineseAgriculturalScienceBulletin血紅雞爪槭葉片總RNA提取方法的比較研究張琰1，安龍杰2，史寶勝2，卓麗環(huán)12（1上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海松江201600；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000）摘要：血紅雞爪槭葉片中富含多糖、多酚物質(zhì)，嚴(yán)重影響了RNA提取純度和質(zhì)量。為了獲得適宜血紅雞爪槭葉片總RNA提取的方法，采用柱式植物RNAout法、TRIZOL法和改良CTAB法3種提取方法對(duì)其葉片總RNA提取效果進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，采用柱子法提取獲得的總RNA產(chǎn)率最高，但是有DNA污染；TRIZOL法提取的總RNAOD

2、260/OD280為1.65，可能有多糖和酚類物質(zhì)的污染，并且產(chǎn)率最低；改良CTAB法提取的總RNA純度很高，OD260/OD280平均值在2.0左右，產(chǎn)率在上述2種方法之間，電泳圖清晰，而且改良CTAB法提取的總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得了清晰的特異性條帶。表明改良CTAB法提取的總RNA純度和產(chǎn)率高，完全可以滿足進(jìn)一步分子生物學(xué)研究的需要，是血紅雞爪槭葉片總RNA提取的適宜方法。關(guān)鍵詞：血紅雞爪槭；總RNA提取；RT-PCR中圖分類號(hào)：S687.9，S792.35文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：2010-1622ComparisonofTotalRNAIsolationfromtheLeafofA

3、cerpalmatum(1ShanghaiVocationalTechnicalCollegeofAgriculture&Forestry,SongjiangShanghai201600;2ZhangYan1,AnLongjie2,ShiBaosheng2,ZhuoLihuan1HebeiAgricultureUniversity,BaodingHebei071000)RT-PCR0引言血紅雞爪槭（AcerpalmatumBloodgood）為槭樹第一作者簡(jiǎn)介：張琰，女，1981年出生，碩士，講師，主要從事園林植物及應(yīng)用方面的研究。通信地址：201600上海市松江區(qū)中山二路658號(hào)上海

4、農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝園林系，E-mail：zhangyan8108。收稿日期：2010-05-25，修回日期：2010-10-25。崖、枯干等樣式，風(fēng)雅別致。近幾年來，關(guān)于血紅雞爪槭的研究報(bào)道較多，內(nèi)容主要涉及植物生理和組織培養(yǎng)等方面；但有關(guān)其分子生物學(xué)的研究報(bào)道較少，從植物組織中提取高質(zhì)量的總RNA是開展各項(xiàng)植物分子生物學(xué)的前提和基礎(chǔ)，是研究基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。目前，已有許多關(guān)于植物組織RNA提取的研究1-5，最常用的有異硫氰酸胍法6、CTAB法7、SDS-苯酚法8及各種試劑盒法等。目前這些方法都已成功運(yùn)用到植物組織RNA提取過程中，但由于血紅雞爪槭為彩色葉植物，含有較多的多糖和多酚，尤其是

5、多酚物質(zhì)對(duì)核酸的提取產(chǎn)生很大的困難，從而影響下一步的分子生物學(xué)研究。為此，筆者采用植物柱子法、TRIZOL法和改良CTAB法9提取血紅雞爪槭葉片總RNA。通過RNA純度、電泳圖譜、得率等分析并確立了適于血紅雞爪槭葉片總RNA提取的方法，為深入進(jìn)行血紅雞爪槭的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，為其他彩色葉樹種的總RNA提取也有借鑒意義。1材料與方法1.1材料與試劑血紅雞爪槭葉片選自大田生長(zhǎng)良好的植株。柱式植物RNAOUT購自TIANDZ公司，TRIZOL試劑盒購自Invitrogen公司，改良CTAB法藥品均是自己配制，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，引物由上海生工設(shè)計(jì)。供試試劑（除含Tris者）和塑

6、料耗材預(yù)先用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）37處理24h以上，然后濕熱滅菌；研缽等玻璃制品均180高溫干熱滅菌12h以上以避免RNA酶的污染10。1.2總RNA提取方法（1）取100mg血紅雞爪槭葉片置液氮種冷凍，研磨成粉，迅速置入盛有1mLRNA提取緩沖液1（含100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、25mmol/LEDTA(pH8.0)、1.4mol/LNaCl）的離心管中，再加入1%-巰基乙醇，顛倒混勻，置于冰浴中30min，其間不斷混勻，防止樣品結(jié)凍凝固于管底。（2）于4下以12000r/min離心1min，棄上清，加入700L65預(yù)熱的RNA提取緩沖液2(含20g/LCT

7、AB、20g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、100mmol/LTris-HCl（pH8.0）、25mmol/LEDTA與2mol/LNaCl)，加1%-巰基乙醇，震蕩混勻，于65水浴20min，離心10min。（3）吸取上清液于新離心管中，每管加入等體積水飽和酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），輕輕顛倒混勻，冰上放置10min，4條件下12000r/min，離心10min。（4）吸取上清于新離心管中，每管加入1/20體積4mol/LKAc(pH5.5)、1/10體積-20預(yù)冷的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，加入等體積氯仿:異戊醇（24:1），顛倒混勻，冰上放置10min。（5）4條件下12000r/m

8、in，離心10min。（6）取上清于新離心管中進(jìn)行RNA的沉淀。上清液中加入1/3體積的LiCl(8mol/L)8，使LiCl終濃度為2mol/L，再加入1%-巰基乙醇。4過夜沉淀。（7）4條件下12000r/min，離心15min；棄上清，用75%乙醇漂洗沉淀，然后再12000r/min，離心5min。（8）沉淀微干后加入500LSSTE（含0.5%SDS、10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1.0mmol/LEDTA(Ph8.0)、1.0mol/LNaCl）緩沖液溶解沉淀，加入等體積氯仿:異戊醇抽提2次。（10）412000r/min，離心10min，收集沉淀；用75%乙醇漂洗

9、2次，重復(fù)上述離心。（11）用一次性槍頭吸盡殘存的乙醇；將打開管蓋的離心管放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上幾分鐘，使殘存的乙醇揮發(fā)掉，不要讓RNA干透。（12）加50LDEPC處理過的水，將RNA存儲(chǔ)于-80備用。1.3RNA質(zhì)量與濃度檢測(cè)取1LRNA樣品，用ND-1000核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行含量以及純度的測(cè)定。取5LRNA加1L6×LoadingBuffer，然后在1.0%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液下，10V/cm穩(wěn)壓壓條件下電泳15min，對(duì)RNA純度和完整性進(jìn)行電泳檢測(cè)。1.4RT-PCR驗(yàn)證以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈。具體方法參照PrimeScriptRev

10、erseTranscriptase試劑盒說明書進(jìn)行的。PCR擴(kuò)增的引物按照花青素合成酶ANS序列設(shè)計(jì)（P51：張琰等：血紅雞爪槭葉片總RNA提取方法的比較研究Co-S2Ct-S2Tr-S2圖1血紅雞爪槭葉片總RNA含量測(cè)定圖譜表1總RNA的質(zhì)量與產(chǎn)率提取方法植物柱子法樣品Co-S1Co-S2Ct-S1Ct-S2Tr-S1Tr-S2OD260/OD280OD260/OD230改良CTAB法TRIZOL法5'-CCAGCGATCCCAAAAGAGT-3'；P31：5'-TGGGCGGCTCACAGAAAAC-3'）。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50L，依次加入模板cDNA2L，引

11、物P51和P31各2L，10mmol/LdNTP2L，10×PCRBuffer5L，25mmol/LMg2+2L，ddH2O34.5L，Taq酶0.5L。反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性3min，941min，481min，721min30s；30次循環(huán)；7210min；4保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離。2結(jié)果與分析2.1總RNA的質(zhì)量與產(chǎn)率利用ND-1000核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定3種提取方法所獲得的血紅雞爪槭葉片RNA含量（如圖1），總RNA純度及產(chǎn)率的計(jì)算結(jié)果見表1。一般而言，通過OD260/OD280作為參考值來檢測(cè)RNA純度，OD260/OD280在1.92.1之間，可以

12、認(rèn)為RNA的純度較好。OD260/OD280值小于1.8，則表明蛋白、多糖和酚類物質(zhì)較多。OD260/OD280值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解。OD260/OD230值應(yīng)大于2.0，若小于2.0，則表明裂解液中有酚類物質(zhì)和-巰基乙醇?xì)埩簟?種方法經(jīng)核酸分析儀檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)植物柱子法產(chǎn)率最高，但是有嚴(yán)重的DNA污染；TRIZOL法不僅產(chǎn)率低，并且OD260/OD280僅為1.65，可能有酚類物質(zhì)的污染，這與胡曉靜等1報(bào)道的基本一致。改良CTAB法純度很高，并且產(chǎn)率也較高。2.2血紅雞爪槭葉片總RNA樣品的電泳檢測(cè)RNA樣品的凝膠電泳分析是判斷RNA質(zhì)量的一種重要手段，從電泳膠上18S和28Sr

13、RNA的完整性可以判斷RNA有無降解及降解程度，也可以判斷有無DNA污染。如圖2所示，柱式植物RNAout法提取得到的總RNA，18S和28S條帶清晰，并且28S亮度是18S的2倍左右，也沒有降解的跡象，但是有明顯的DNA污染，TRIZOL法提取的總RNA，18S和28S條帶不清晰，亮度過弱，有降解的跡象，改良CTAB法提取的總RNA，18S和28S條帶清晰，28S亮度是18S的2倍1235628S18S12：柱式植物RNAout法；34：改良CTAB法；56：TRIZOL法圖2血紅雞爪槭葉片RNA瓊脂糖凝膠電泳圖左右，沒有降解跡象，也未發(fā)現(xiàn)DNA的污染。2.3血紅雞爪槭葉片RNA樣品的cDN

14、A的合成及質(zhì)量檢測(cè)用改良的CTAB方法提取的RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增DNA，以檢測(cè)RNA的質(zhì)量。RT-PCR電泳結(jié)果如圖3所示，以cDNA為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增得到一條清晰的特異性條帶，說明了反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA質(zhì)量很好，這進(jìn)一步說明用改良CTAB法提取的RNA具有較高的質(zhì)量，可供分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)使用。3討論大多數(shù)植物，尤其是彩葉植物都含有多糖和酚類物質(zhì)，血紅雞爪槭跟其他彩葉植物比較，其植株體內(nèi)多糖和酚類物質(zhì)的含量更高，這2種物質(zhì)嚴(yán)重影響RNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)率，所以有效去除多糖和酚類物質(zhì)是成功提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，很難將它們分開，

15、在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液10。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。筆者建立的改良CTAB法與前人研究9不同的是在利用CTAB提取液2裂解細(xì)胞之前，先進(jìn)行提取緩沖液1抽提，去除細(xì)胞內(nèi)部分可溶性糖、蛋白，色素等物質(zhì)，在酚:氯仿:異戊醇抽提時(shí)分層界限清晰，上清液粘度大大降低，易于吸取，因此這一步顯著降低了糖、蛋白的含量，對(duì)多糖含量高的植物RNA提取是關(guān)鍵步驟之一。在進(jìn)行植物材料研磨和勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來，氧化后

16、使勻漿液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加kb1231：DL2000marker；23：特異性PCR產(chǎn)物圖3RT-PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browningeffect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化11。酚類物質(zhì)的去除，關(guān)鍵的是防止酚類氧化。-巰基乙醇能夠抑制多酚氧化酶的活性，進(jìn)而抑制多酚氧化，宋蓓等9采用改良CTAB-LiCl法提取棗總RNA時(shí)在提取緩沖液2中加入了1%的-巰基乙醇就達(dá)到理想的效果，但對(duì)于多酚含量高的血紅雞爪槭來說，僅此一步遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，提出的總RNA顏色微紅，難以溶解。因此經(jīng)過多次探究，分別在提取緩沖液1

17、、2中加入了1%的-巰基乙醇。除此之外，LiCl沉淀這步也必須加入1%的-巰基乙醇，才能達(dá)到理想的去除效果。4結(jié)論在前人的研究基礎(chǔ)上，比較了柱式植物RNAout法、TRIZOL法和改良CTAB法提取血紅雞爪槭總RNA的提取效果，主要結(jié)論如下：（1）建立了一套適合于血紅雞爪槭總RNA提取的改良CTAB法，也為多糖多酚含量高的其他彩葉植物總RNA提取提供借鑒。（2）改良的CTAB法獲得高質(zhì)量的總RNA，可進(jìn)行Northern雜交分析，mRNA純化以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR或基因差異顯示分析等分子生物學(xué)研究。（3）改良的CTAB法用時(shí)較短，可操作性強(qiáng)，藥品廉價(jià)，試驗(yàn)成本低。參考文

18、獻(xiàn)1胡曉靜,何培民.條斑紫菜絲狀體總RNA提取方法比較J.生物技術(shù)通訊,2007,18(4):604-607.2徐昌杰,陳昆松,張波,等.柑橘組織RNA提取方法研究J.果樹學(xué)報(bào),2004,21(2):136-140.3董占強(qiáng),翟曉巧,范國(guó)強(qiáng),等.泡桐葉片RNA提取方法的研究J.河張琰等：血紅雞爪槭葉片總RNA提取方法的比較研究南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,43(1):40-43.456侯義龍,張開春,吳祿平,等.果樹組織中總RNA提取的新方法J.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33(2):122.王玉成,楊傳平,姜靜.木本植物組織總RNA提取的要點(diǎn)與原理J.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,30(2):1-4.CHOMCZYNSKIP,SACCHIN.Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanale-phenol-chloroformextractionJ.AnalyticalBiochemistry,1987,162:156-159.7CHANGSJ,JEFFP,JOHNC.ASimpleandefficientmethodforisolatingRNAfrompinetreesJ.PlantMolecularBiologyReporter,981993,11(2):113-116.VANDRIESSCHEES