CD147分子在膽管癌浸潤及轉(zhuǎn)移中作用及機(jī)制的研究

1、CD147分子在膽管癌浸潤及轉(zhuǎn)移中作用及機(jī)制的研究 作者：賀偉旗，王曙光，顧建文，匡永勤，程敬民，邢學(xué)民，楊文濤，張俊海【摘要】 目的 了解CD147與膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 通過RTPCR和免疫熒光法了解CD147在膽管癌細(xì)胞株QBC939中的表達(dá)，然后構(gòu)建反義CD147分子基因片斷的重組腺病毒抑制膽管癌細(xì)胞株CD147分子的表達(dá)，觀察其基質(zhì)金屬酶MMPs改變及生長情況。結(jié)果 CD147分子在膽管癌細(xì)胞株QBC939中表達(dá)，表明反義CD147通過抑制腫瘤細(xì)胞的CD147分子的表達(dá)，主要減少了腫瘤組織中基質(zhì)金屬酶MMP2，而不是MMP9的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的生長抑制。結(jié)論 CD147分子的高表

2、達(dá)能夠促進(jìn)膽管癌的腫瘤生長，并且CD147促進(jìn)腫瘤生長的能力可能與MMP2的高表達(dá)密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 膽管癌；CD147；腫瘤轉(zhuǎn)移；MMP2；MMP9 Abstract: Objective To explore whether CD147 had involved in the metastasis and invasion of bile duct cancer or not.Methods The expression of CD147 in bile duct cancer cell strain QBC939 was surveyed by RTPCR and indirect

3、immunofluorescence. Then a recombinant adenoviral vector containing CD147 cDNA in an antisense orientation was constructed and transfected to QBC939. The matrix metalloproteinase (MMPs) and the growth of QBC939 with antisensed CD147 cDNA were tested. Results In this study, the expression of CD147 in

4、 human bile duct cancer cell strain QBC939 was confirmed by RTPCR and indirect immunofluorescence. The results showed that the antisensed CD147 can inhibit the invasion and metastasis of bile duct cancer cells by decreasing the expression level of MMP2,not MMP9.ConclusionThis study indicates that bl

5、ocking the molecule expression of CD147 may be an effective way to inhibit the development of the tumor. Keywords: bile duct cancer; CD147; metastasis 膽管癌可通過多種途徑轉(zhuǎn)移1。CD147是一種廣泛分布于多種細(xì)胞的屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IgSF)的跨膜糖蛋白。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有CD147表達(dá)的增高，并與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。有學(xué)者從人肺癌LX1細(xì)胞膜上分離出來CD147MMP1復(fù)合物，說明C

6、D147不僅能刺激纖維母細(xì)胞產(chǎn)生MMP1，還能結(jié)合MMP1于腫瘤細(xì)胞表面，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤2。有研究表明，MMPs在膽管癌的浸潤及轉(zhuǎn)移中也起了很重要的作用34。而CD147是否參與調(diào)節(jié)膽管癌的浸潤及轉(zhuǎn)移過程，CD147刺激MMPs產(chǎn)生的作用及兩者的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究設(shè)想對(duì)于MMP上游的CD147分子進(jìn)行干預(yù)將會(huì)對(duì)膽管癌的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，從而對(duì)膽管癌的浸潤及轉(zhuǎn)移起到抑制或阻斷的作用。以膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞為研究對(duì)象，首先了解CD147分子在其中的表達(dá)，并通過構(gòu)建攜帶反義CD147分子的腺病毒載體，將其轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞，以觀察減少CD147分子信號(hào)通路對(duì)膽管癌

7、體外及體內(nèi)生物學(xué)行為的影響，探討CD147的表達(dá)與MMPs之間的關(guān)系及在膽管癌浸潤及轉(zhuǎn)移中的作用。1 材料與方法1.1 材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：人膽管癌細(xì)胞株QBC939由全軍肝膽外科研究所建立。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康純種SPF級(jí)BALB/C 6周齡雌性裸鼠15只，體重（24±3）g，購自上海藥物研究所實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心。實(shí)驗(yàn)試劑：各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、RTPCR試劑盒購自Roche公司。PCR產(chǎn)物試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA快速連接試劑盒購自寶生物公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectin Reagent購自Invitrogen公司，A

8、dEasy XL Adenoviral Vector System試劑盒購自Stratagene公司。FITC標(biāo)記和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗人CD147抗體、兔抗人MMP2抗體和兔抗人MMP2抗體購自武漢博士德公司。1.2 方法1.2.1 QBC939細(xì)胞中CD147 mRNA表達(dá)檢測（RTPCR）登錄Genebank根據(jù)人CD147的基因序列，運(yùn)用Primer5軟件設(shè)計(jì)得到目的基因引物：5GAAGGAAGTGTATGATGGGAAT3和5GCGGTTGGAGGTTGTAGG3。提取培養(yǎng)72h的QBC939細(xì)胞總RNA，按RTPCR試劑盒說明書行cDNA鏈的合成和PCR擴(kuò)增，所得到的PC

9、R產(chǎn)物通過凝膠電泳進(jìn)行鑒定。1.2.2 免疫熒光法檢測QBC939細(xì)胞中CD147蛋白表達(dá)QBC939細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，PBS洗滌3次，用4%的多聚甲醛固定。滴加未標(biāo)記的兔抗人CD147抗體(1200)，37 孵育30 min后，PBS洗滌3次。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1100)，37 孵育30 min后，PBS洗滌3次，并置于熒光顯微鏡下觀察。1.2.3 反義CD147腺病毒載體的構(gòu)建及擴(kuò)增通過PCR方法擴(kuò)增人全長CD147 cDNA片斷，擴(kuò)增的cDNA連接到pGEM TEasy質(zhì)粒中進(jìn)行大量擴(kuò)增。得到的CD147 cDNA片斷與pShuttleCMV質(zhì)粒反向連接，連接后得到p

10、ShuttleCMVasCD147，同時(shí)轉(zhuǎn)DH5感受態(tài)菌株進(jìn)行擴(kuò)增、酶切和電泳鑒定。pShuttleCMVasCD147穿梭質(zhì)粒在BJ5183菌株中與pADEasy質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，將目的基因重組到腺病毒基因組質(zhì)粒中得到pADEasyCMVasCD147質(zhì)粒，同時(shí)進(jìn)行克隆擴(kuò)增和酶切鑒定。pADEasyCMVasCD147質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞，47 d后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)；收集病變的QBC939細(xì)胞和培養(yǎng)上清液反復(fù)凍融、離心后進(jìn)行脫水濃縮得到重組腺病毒。1.2.4 Westernblotting檢測反義CD147轉(zhuǎn)染后QBC939細(xì)胞中CD147、MMP2及MMP9蛋白表達(dá) 將QBC939細(xì)胞

11、分為AdasCD147轉(zhuǎn)染組、AdLacZ轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。將各組細(xì)胞裂解蛋白進(jìn)行SDS PAGE電泳后，半干法(1 mA/cm2，60 min)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗人CD147抗體、MMP2及MMP9（1200），4 過夜，1TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（15 000），37 孵育1 h，1TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑檢測。1.2.5 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)將6周齡雌性BALB/C裸鼠15只，隨機(jī)分為3組：PBS對(duì)照組、AdLacZ組和AdasCD147組，每組5只。分別取對(duì)數(shù)期生長的PBS對(duì)照組、AdLacZ轉(zhuǎn)染組和AdasCD147轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞懸液，

12、調(diào)整到細(xì)胞數(shù)5×107/mL后，每只裸鼠皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液。接種1周后用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（S2），計(jì)算腫瘤的體積（V），計(jì)算公式為V=L×S2×0.4。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 11.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及檢驗(yàn)，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢測均值有無顯著性差異，P<0.05為有顯著性差異。2 結(jié)果2.1 QBC939細(xì)胞中CD147 mRNA的表達(dá) RTPCR擴(kuò)增可見QBC939細(xì)胞中CD147 mRNA有表達(dá)。擴(kuò)增基因片段大小為986 bp，與預(yù)期的大小相等（圖1）

13、。2.2 QBC939細(xì)胞中CD147蛋白表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示，CD147是一種膜蛋白，主要表達(dá)在QBC939細(xì)胞的胞膜上，在胞漿中也有少量的表達(dá)(圖2)。2.3 反義CD147轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞后CD147、MMP2和MMP9蛋白表達(dá) 運(yùn)用Westernbloting檢測反義CD147轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞后CD147、MMP2及MMP9蛋白表達(dá)變化見圖3。運(yùn)用Mias軟件分析各條帶的積分光密度值，發(fā)現(xiàn)經(jīng)反義CD147轉(zhuǎn)染后，QBC939細(xì)胞中CD147蛋白表達(dá)與對(duì)照組及LacZ組相比較明顯下調(diào)(P<0.01)；反義CD147組MMP2蛋白表達(dá)與在對(duì)照組及LacZ組相比明顯下

14、調(diào)(P<0.01)；而MMP9無明顯變化(P>0.05)。所有對(duì)照組與LacZ組相比，CD147、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)。2.4 反義CD147對(duì)腫瘤體積增長的影響 15只裸鼠接種腫瘤細(xì)胞，種植1周后計(jì)算腫瘤的體積，結(jié)果表明，三組腫瘤體積均有增長，從第2周開始，反義CD147組對(duì)比LacZ組、PBS組，腫瘤增幅明顯減少(P<0.01)；而LacZ組與對(duì)照組比較，腫瘤增幅無明顯差異(P>0.05)，說明反義CD147組的腫瘤生長受到明顯的抑制(圖4)。3 討論 CD147參與多種不同的生理過程并

15、具有多種不同的生理功能56。有研究發(fā)現(xiàn)，癌周間質(zhì)細(xì)胞與癌細(xì)胞的相互作用可顯著上調(diào)MMPs在癌變組織中的分泌水平，而表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的CD147分子可以對(duì)腫瘤及瘤周的MMPs有調(diào)節(jié)的作用7，CD147分子是腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移的一個(gè)不可忽視的因子。 在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有CD147表達(dá)的增高，在部分腫瘤中隨著腫瘤惡性程度的增高，CD147的表達(dá)也增高。有研究表明CD147分子在轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達(dá)更高，推測在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的CD147通過刺激腫瘤周及瘤內(nèi)的成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移8。Zucker等將EMMPRIN(CD147)轉(zhuǎn)染人類乳腺癌細(xì)胞株MDAMB436后種植裸鼠，轉(zhuǎn)染

16、的細(xì)胞株與未轉(zhuǎn)染者相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤性及浸潤性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)腫瘤中膠原酶MMP2及MMP9的表達(dá)增加，據(jù)此推測，CD147在腫瘤浸潤及生長中通過促進(jìn)MMPs的表達(dá)而起重要作用9。MMPs在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，其中最重要的是MMP2和MMP910。MMPs主要通過以下幾種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲性生長：MMPs作用使腫瘤細(xì)胞周圍的物理屏障破壞；MMPs可重塑細(xì)胞間粘附力，以便腫瘤細(xì)胞向周圍生長；MMPs通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進(jìn)腫瘤新血管的形成11。同時(shí)，活化的MMPs可使其他MMPs活化，其具有相互激活的能力12。 本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)膽管癌細(xì)胞表達(dá)CD147分子,同時(shí)進(jìn)一步通過反義CD1

17、47分子轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞株下調(diào)腫瘤細(xì)胞的CD147分子后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中MMP2的表達(dá)量也隨之明顯下調(diào)，而MMP9卻沒有變化。這表明CD147分子的表達(dá)與膽管癌細(xì)胞中MMP2的表達(dá)密切相關(guān)，CD147分子表達(dá)的下調(diào)可使MMP2的表達(dá)明顯下降。而CD147調(diào)節(jié)MMP2的信號(hào)通路及機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。通過裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)了CD147分子的膽管癌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生長速度明顯減緩，表明CD147分子的高表達(dá)能夠促進(jìn)膽管癌的腫瘤生長，并且CD147促進(jìn)腫瘤生長的能力可能與MMP2的高表達(dá)密切相關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 王曙光，韓本立，陳意生，等.膽管癌轉(zhuǎn)移途徑的研究J.中華外科雜志，1996，34(6

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19、門膽管癌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2及其組織抑制因子TIMP2表達(dá)及意義的研究J.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2002，5(2):80-84.5 Yurchenko V, OConnor M, Dai WW, et al. CD147 is a signaling receptor for cyclophilin BJ. Biochem Biophys Res Commun, 2001,288(4):786-788.6 Pushkarsky T, Zybarth G, Dubrovsky L, et al. CD147 facilitates HIV1 infection by interacting w

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