2009CB940900-發(fā)育與生殖相關(guān)的小分子化合物庫及相關(guān)技術(shù)平臺的建立(1)_修正版

1、修正版項目名稱：首席科學家：起止年限：依托部門：發(fā)育與生殖相關(guān)的小分子化合物庫及相關(guān)技術(shù)平臺的建立謝欣中國科學院上海生命科學研究院2009.1 至 2013.8中國科學院修正版、研究內(nèi)容擬解決的關(guān)鍵問題:隨著基因轉(zhuǎn)染誘導體細胞重編程為干細胞的成功，干細胞研究進入了一個 新的階段。然而采用化學生物學的策略，將小分子化合物用于干細胞的自我更新、定向分化以及體細胞重編程等方面的研究卻僅在近幾年才剛剛起步。本項目擬圍 繞小分子化合物調(diào)控干細胞這一目標，解決如下科學問題:1. 能否應(yīng)用小分子化合物維持干細胞全能性、誘導干細胞定向分化及體細胞重編程？目前只有為數(shù)不多的小分子化合物被報道與維持干細胞自我更新

2、或促進定向分化相關(guān)，但這些化合物還不足以完全取代培養(yǎng)基中的生長因子,且誘導分化的百分比也不能滿足臨床應(yīng)用的需要。而在體細胞重編程研究中，只有數(shù)個小分子化合物被報道可以增強轉(zhuǎn)錄因子誘導效率，但完全替代轉(zhuǎn)錄因子的研究還未有報道。能否應(yīng)用小分子化合物維持干細胞全能性、誘導干細胞定向分化及體細胞重編程是本項目擬解決的一個關(guān)鍵科學問題。要解決這個問題我們需要建立具有一定結(jié)構(gòu)多樣性及靶標針對性的小分子化合物庫及靈敏、穩(wěn)定的活性鑒定和篩選模型。2. 干細胞調(diào)控相關(guān)的小分子化合物庫的建立。利用篩選模型，通過對化合物庫的高通量篩選是獲得具有生物活性的小分子化合物的有效途徑。國內(nèi)也有單位進行類似篩選以獲得小分子藥

3、物先導化合物。 但目前國內(nèi)的化合物庫容量比較小，而且化合物挑選也是隨機進行，因此活性化合物的命中率非常低。國際上目前已開發(fā)出針對一類配體的化合物庫,如針對G蛋白偶聯(lián)受體、核受體、離子通道或激酶的化合物庫，但針對干細胞調(diào)控的小分子化合物庫尚未報道。因此干細胞調(diào)控相關(guān)的小分子化合物的挑選及庫的建立也是本項目擬解決的一個關(guān)鍵科學問題。我們將通過生物/化學信息學及計算生物學，建臺,立虛擬篩選平臺，挑選可能與干細胞調(diào)控關(guān)鍵蛋白或通路有相互作用的小分子化合物或天然產(chǎn)物，用于活性研究；另我們也將建立合成平臺，對已有報道的或我們篩選發(fā)現(xiàn)的活性化合物進行結(jié)構(gòu)改造和修飾，合成衍生物庫，用于活性篩選。通過化學與生物

4、學的結(jié)合建立干細胞調(diào)控相關(guān)的小分子化合物庫。3. 干細胞自我更新、定向分化及體細胞重編程模型的建立。有了具有一定結(jié)構(gòu)多樣性及靶標針對性的小分子化合物庫，還必需建立靈敏、穩(wěn)定的活性鑒定和篩選模型，才能從庫中發(fā)現(xiàn)具有干細胞調(diào)控活性的化合物。因此干細胞自我更新、定向分化及體細胞重編程模型的建立是本項目擬解決的另一個關(guān)鍵科學問題。我們擬在已有的人、猴、小鼠胚胎干細胞系培養(yǎng)技術(shù)平臺基礎(chǔ)上， 利用形態(tài)、標記分子、干細胞多能因子 Oct4/Nanog以及細胞的表觀遺傳修飾狀態(tài)等方面的變化來綜合評價表達來評價干細胞的多能性或分化狀態(tài)，從而建立活性鑒定模型。主要研究內(nèi)容1. 建立生殖和發(fā)育相關(guān)特別是干細胞研究相

5、關(guān)的小分子化合物及天然化合物庫，為相關(guān)領(lǐng)域的科學家提供研究及活性篩選用的化合物資源:通過文章、專利等檢索收集已有報道的、與干細胞誘導、增值及定 向分化相關(guān)的小分子化合物信息，通過購買或合成收集此類已有報 道活性的化合物(70100個)，為科學家提供相關(guān)研究的標準化合物； 通過對干細胞相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路或其中重要蛋白質(zhì)的計算生物學研 究及虛擬篩選，挑選并收集可能具有干細胞調(diào)控功能的天然化合物, 擴充化合物庫，為進一步的活性鑒定實驗提供材料;挑選、收集具有結(jié)構(gòu)新穎性及成藥性的小分子化合物擴充化合物庫, 為進一步的活性鑒定實驗提供材料;利用網(wǎng)絡(luò)和電子技術(shù)，建立我國干細胞相關(guān)化合物資源的中心數(shù)據(jù) 庫系統(tǒng)

6、(包括網(wǎng)站、綜合數(shù)據(jù)庫和多層多點的操作管理界面)以匯 總和共享有關(guān)小分子化合物調(diào)控干細胞的信息；推廣小分子化合物 調(diào)控干細胞的知識、技術(shù)、操作經(jīng)驗等;建立化合物庫的管理運行規(guī)范、建立合理的化合物資源共享機制。2. 建立穩(wěn)定的小分子化合物調(diào)控干細胞的活性鑒定和篩選平臺，研究小分子化合物在干細胞全能性維持、定向分化及體細胞向干細胞重編程方面的功能;1)建立維持干細胞多能性小分子化合物的篩選平臺：在已有的人、猴、小鼠胚胎干細胞系培養(yǎng)技術(shù)平臺基礎(chǔ)上，按形態(tài)、表面分子SSEA和核內(nèi)因子Oct4/Nanog的表達來評價干細胞的多能性狀態(tài)，通過小 分子化合物對干細胞短期和長期培養(yǎng)的影響，來檢測、驗證其功能，

7、 同時檢測它們對干細胞的毒性;2)建立誘導干細胞定向分化的小分子化合物篩選平臺：在已有的胚胎 干細胞系培養(yǎng)和分化技術(shù)平臺基礎(chǔ)上，加入小分子化合物與胚胎干細胞共培養(yǎng)，利用各種細胞的特定分子標記建立定向分化篩選模型, 從化合物庫中篩選出能促進或阻斷定向分化過程的小分子化合物并 以之為探針進行蛋白靶標鑒定和分化機制的研究;3)建立誘導iPS的小分子化合物篩選平臺：我們已利用反轉(zhuǎn)錄病毒導入了 4個轉(zhuǎn)錄因子基因(Oct-4, Sox2, c-Myc和KLF4)，成功地進行了人與小鼠體細胞向iPS干細胞的誘導。在此基礎(chǔ)上，我們將通過小分子化合物的共孵育來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子對iPS的誘導效率，并逐漸利用篩選出的活

8、性化合物替代 4種轉(zhuǎn)錄因子中的1種到多種，最 終實現(xiàn)完全用化合物組合高效誘導形成iPS。3. 建立化學合成平臺，針對性地合成可能參與干細胞命運調(diào)控的信號通路的小 分子調(diào)節(jié)劑，構(gòu)建調(diào)控干細胞命運的小分子化合物庫。利用化學合成平臺，對文獻報道的可有效維持干細胞自我更新能力、誘導干細胞定向分化以及成體細胞重編程的大約100個小分子化合物開發(fā)有效的化學合成方法并完成其化學合成，每個化合物合成200mg，為干細胞命運調(diào)控研究提供標準化合物;在對文獻報導的或篩選獲得的可有效調(diào)控干細胞命運的小分子化合 物合成的基礎(chǔ)上，對它們的進行比較系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)多樣化改造，初步 構(gòu)建一個約有25003000個小分子化合物的小

9、型定向化合物庫, 為進行可調(diào)控干細胞命運的小分子化合物的篩選提供初步的重要物 質(zhì)基礎(chǔ);一些調(diào)控細胞生長、增殖等信號轉(zhuǎn)導通路如MAPK、Hedghog、Notch、致死因子(Death receptor ) /NF B、Akt、Wnt 和蛋白激酶/磷酸酶等信號通路在干細胞的自我更新、定向分化中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。我們將以已有文獻報道的且有代表性而尚未商業(yè)化的這 些信號通路的小分子調(diào)節(jié)劑為基礎(chǔ)，對它們進行有效的化學合成并進行結(jié)構(gòu)多樣化改造，構(gòu)建信號通路導向性小分子化合物庫(Sig nalP athway Orie nted Chemical Library, SP OCL。二、預(yù)期目標總體目標本

10、項目總體目標是聯(lián)合國內(nèi)干細胞研究、 天然產(chǎn)物化學及有機合成的主要力量，優(yōu)勢集成，技術(shù)互補，建立能滿足發(fā)育與生殖領(lǐng)域基礎(chǔ)與應(yīng)用研究需求，特別是干細胞重編程、全能性維持及定向分化研究相關(guān)的小分子化合物與天然產(chǎn)物庫，以及相應(yīng)的合成平臺、活性鑒定與篩選平臺；并通過對小分子化合物在干細胞信號通路中的活性鑒定和篩選，尋找可以維持干細胞全能性、定向誘導干細胞分化或誘導體細胞向干細胞重編程的化合物組合。通過本項目的實施，我們將整合國內(nèi)現(xiàn)有的主要干細胞研究、 藥物化學、天然產(chǎn)物化學及計算化學的力量， 在項目實施的5年內(nèi)，分階段地建立起全國共享的發(fā)育與生殖及干細胞研究相關(guān)的化合物庫及活性鑒定和篩選平臺，建立和完善

11、化合物庫的管理運行規(guī)范和資源共享機制，向國內(nèi)相關(guān)研究同行提供干細胞研究相關(guān)的小分子化合物、信息（數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站）和技術(shù)的支撐等；同時，培養(yǎng)一批高水平研究人才，推動我國在小分子調(diào)控發(fā)育與生殖以及誘導干細胞領(lǐng)域的發(fā)展。五年預(yù)期目標:1.小分子化合物庫的建立：建成總量為 2500030000個化合物的小分子化合物庫用于發(fā)育與生殖領(lǐng)域特別是干細胞調(diào)控方面的研究，建立化合物庫的管理運行規(guī)范、建立合理的化合物資源共享機制。庫中主要包括5類化合物:a)第一類是已有報道的與干細胞調(diào)控通路相關(guān)的活性化合物, 個，將作為干細胞研究的標準化合物；大約70100b)c)第二類是天然小分子化合物單體（3000個）；第三類

12、是經(jīng)標準程序提取的中草藥組分（2000個）；d)第四類是具有新穎結(jié)構(gòu)的合成小分子化合物（20000個）；e)第五類是已有報道的活性化合物和通過我們篩選獲得的活性化合物的衍生物（3000個）。2. 干細胞調(diào)控相關(guān)蛋白或信號通路的虛擬篩選平臺的建立：根據(jù)與干細胞多能性維持、定向分化及體細胞重編程相關(guān)的蛋白、信號通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立干細胞形成和分化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫SCRPD (Stem Cell RelatedProtein Database），建立和完善天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫CNPD （Chinese NaturalProduct Database) o應(yīng)用化學信息技術(shù)、生物信息技術(shù)和計算機虛擬篩選

13、方 法，針對SCRPD中的所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，搜尋 CNPD數(shù)據(jù)庫，獲得具有調(diào)控干細胞形成或分化的天然產(chǎn)物信息。 根據(jù)上述計算結(jié)果，收集天然產(chǎn)物樣品,并為活性化合物的結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。3. 干細胞調(diào)控相關(guān)的小分子活性檢測平臺的建立：建立干細胞自我更新、定向分化及體細胞重編程三個活性篩選平臺，建立9-12種可用于高通量篩選的干細胞或分化細胞株，三個篩選平臺中每個平臺擁有3-4種穩(wěn)定細胞株。通過上述平臺篩選并驗證能影響這些過程的小分子化合物，篩選出10-15個能有效影響干細胞多能性與自我更新的小分子化合物，10-15個能有誘導或阻斷細胞定向分化的化合物，8-10個能促進或抑制iPS效率的小分子化合物，

14、8-10個能激活iPS關(guān)鍵基因或其下游基因的小分子化合物，3-5個能部分或完全替代iPS中4個轉(zhuǎn)錄因子的小分化合物。并以篩選到的小分子化合物為探針找出35個與干細胞多能性和細胞定向分化相關(guān)的靶標蛋白， 并進行深入的研究干細胞自我更新、定向分化和重編程的分子機理，爭取實現(xiàn)化學方法誘導 iPS。70 1004. 活性小分子有機合成及結(jié)構(gòu)改造平臺的建立：對文獻報道的可有效維持干細胞自我更新能力、誘導干細胞定向分化以及成體細胞重編程的大約個小分子化合物開發(fā)有效的化學合成方法并完成其化學合成，為干細胞命運調(diào)控研究提供標準化合物；另通過對上述活性化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造，構(gòu)建一個約有25003000個化合物的

15、小型定向化合物庫，為進行可調(diào)控干細胞命運的小分子化合物的篩選提供初步的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；另針對性參與干細胞命運調(diào)控的信號通路，合成其中有代表性而尚未商業(yè)化的小分子調(diào)節(jié)劑并進行結(jié)構(gòu)多樣性改造，構(gòu)建信號通路導向性小分子化合物庫(Signal PathwayOrie nted Chemical Library, SP OCL）。5. 干細胞相關(guān)化合物資源中心數(shù)據(jù)庫的建立：利用網(wǎng)絡(luò)和電子技術(shù)，建立我國干細胞相關(guān)化合物資源的中心數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)(包括網(wǎng)站、綜合數(shù)據(jù)庫和多層多點的操作管理界面)以匯總和共享有關(guān)小分子化合物調(diào)控干細胞的信息；推廣小分子化合物調(diào)控干細胞的知識、技術(shù)、操作經(jīng)驗等。6. 技術(shù)服務(wù)和支持：保障

16、發(fā)育與生殖研究的國家重大科學研究計劃順利完成;向全國相關(guān)同行提供用于干細胞研究的小分子化合物、信息和技術(shù)支撐；在服務(wù)方式上采取多樣化模式以滿足不同研究機構(gòu)和科學家的需要，如：單純提供標準化合物、提供用于活性篩選的化合物、提供小分子化合物對干細胞調(diào)控作用的活性篩選服務(wù)、對用戶的研究方案提供咨詢或根據(jù)研究需要提供技術(shù)方案、受用戶委托完成新技術(shù)的開發(fā)等等。7. 預(yù)期在小分子化合物建庫及活性篩選的過程中將有20-30篇研究論文發(fā)表在有一定影響的國際期刊上。8. 在干細胞相關(guān)研究領(lǐng)域培養(yǎng)高水平的科研隊伍，包括：博士后（>5人）、博士研究生（20-30人）、碩士研究生（20-30人）、技術(shù)員約10人

17、。三、研究方案學術(shù)思路:干細胞已成為發(fā)育與生殖領(lǐng)域研究的重點，其根本原因是干細胞和干細胞技 術(shù)為人類戰(zhàn)勝難治疾病、健康長壽地生活帶來了巨大的希望。國際上干細胞研究 正在進入一個新的發(fā)展階段，其中有關(guān)體細胞重編程為胚胎干細胞、胚胎干細胞的體外全能性維持以及胚胎干細胞的定向分化是干細胞研究中幾個熱點問題。小 分子化合物由于其結(jié)構(gòu)多樣、質(zhì)量易控和可口服利用等特點一直是新藥及工具藥 的重要來源。而小分子化合物參與干細胞調(diào)控的研究目前在國際上雖處于起始階 段，但必將在不遠的將來取得重大突破。我國有著豐富多樣的天然化合物資源, 應(yīng)及早開展小分子化合物在發(fā)育與生殖領(lǐng)域及干細胞誘導、全能性維持和定向分 化方面

18、的研究和應(yīng)用，使我國在上述領(lǐng)域的研究處于國際前沿地位。 本項目將建立國家干細胞調(diào)控相關(guān)的小分子化合物及天然產(chǎn)物庫以及相應(yīng)的合成、活性鑒定 與篩選平臺，制定相應(yīng)的硬件標準、技術(shù)指標、管理規(guī)范，確保資源的共享，以 推進我國在小分子調(diào)控發(fā)育與生殖以及干細胞調(diào)控領(lǐng)域的研究。我們將首先建立能調(diào)控干細胞命運的小分子化合物庫，為后續(xù)篩選工作提供 充足的實驗對象；同時建立干細胞多能性、定向分化和體細胞重編程三個方向的 化合物篩選模型，驗證篩選出的活性化合物，并尋找相應(yīng)靶點；然后運用這些化 合物研究干細胞多能性維持、定向分化和體細胞重編程的分子機制，為篩選模型 的改進提供理論依據(jù)。1. 建立調(diào)控干細胞命運的小分

19、子化合物庫建立有效的篩選模型，通過對化合物庫的高通量篩選是獲得可以調(diào)節(jié)復雜生 命活動的小分子化合物的有效途徑。這種策略的有效性很大程度上依賴于化合物 庫的質(zhì)量。很自然地，化合物庫的容量越大，其中的化合物的結(jié)構(gòu)多樣性越高, 化合物庫的質(zhì)量就越高，進而通過篩選獲得活性化合物的幾率就越大。 但由于有 機化合物的結(jié)構(gòu)千變?nèi)f化，沒有任何一個化合物庫可以涵蓋所有的小分子化合物。另一方面，化合物產(chǎn)生生物學效應(yīng)必須與特定的生物靶點相互作用，而化合物必須具備一定的結(jié)構(gòu)特點才能夠與相應(yīng)的生物靶點作用。因此，通過隨機合成但試圖的方法雖能夠快速構(gòu)建具有一定庫容量和結(jié)構(gòu)多樣性的小分子化合物庫， 從中獲取生物活性分子的幾

20、率卻微乎其微。在構(gòu)建化合物庫時，所選化合物結(jié)構(gòu) 上與潛在靶點的 匹配性”與化合物的結(jié)構(gòu)多樣性及庫容量相比顯得更為重要。因此，在小分子化合物庫構(gòu)建時，我們首先將通過生物信息學及計算生物學 尋找已知的可以調(diào)控胚胎干細胞自我更新和定向分化的小分子化合物的結(jié)構(gòu)特 點，并結(jié)合它們已經(jīng)證實或潛在的生物靶標的特點，保證它們在分子結(jié)構(gòu)的 配性”將以這些已知小分子為基礎(chǔ)定向改造出的新化合物，或通過虛擬篩選獲 得的可能與干細胞調(diào)控蛋白相互作用的小分子化合物組成一個新型小分子化合 物庫用于干細胞調(diào)控活性的篩選，獲得活性化合物的幾率會非常大。1）化學信息及計算生物學平臺的建立：，建立和完善天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫 CNPD（C

21、hi nese Natural P roduct Database），建立干細胞形成和分化相關(guān)的蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 SCRPD （Stem Cell Related Protein Database）。應(yīng)用化學信息 技術(shù)、生物信息技術(shù)和計算機虛擬篩選方法，針對 SCRPD中的所有蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)，搜尋CNPD數(shù)據(jù)庫，獲得具有調(diào)控干細胞形成或分化的天然產(chǎn)物信息。根據(jù)上述計算結(jié)果，收集天然產(chǎn)物樣品，建立干細胞調(diào)控活性天然產(chǎn)物庫, 并為活性化合物的結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。2）有機合成平臺的建立：先針對已報道的可有效調(diào)控干細胞自我更新和定向分化的非商業(yè)化小分子化合物（約100個）開發(fā)有效的合成方法進行化學合成,

22、為干細胞命運調(diào)控研究提供標準化合物。在此基礎(chǔ)上對這些化合物的結(jié)構(gòu)進行比較系統(tǒng)的多樣化改造，初步構(gòu)建一個約有30004000個小分子化合物的小型定向化合物庫，為進行可調(diào)控干細胞命運的小分子化合物的篩選提供初步的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。以可以有效維持胚胎干細胞的自我更新和增殖能力的p38抑制劑SB203580 （圖二）為例，我們可以有效地以該化合物地結(jié)構(gòu)為 基礎(chǔ)衍生出Group 1 - Group 8等一系列具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性，但有可能作用于不同生物靶標的小分子化合物亞庫。而這一個個小分子化合物亞庫就構(gòu)成了可調(diào)控干細胞命運的定向小分子化合物庫。我們還將針對在干細胞命運調(diào)控過程能夠發(fā)揮重要作用的一些關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子如

23、Hedghog 信號通路、Notch信號通路、致死因子（Death receptor ）/NF B信號通路、Akt信號通路、Wnt信號通路和TGF生長因子信號通路等，定向地以已經(jīng)報導的這些信號通路的小分子調(diào)節(jié)劑為基礎(chǔ)，構(gòu)建它們導向性的小分子調(diào)節(jié)化合物庫（約 5001000個化合物）。圖三為針對這些信號的部分已知小分子調(diào)節(jié)劑:另外，與其它幾乎所有的信號轉(zhuǎn)導過程一樣，細胞的命運調(diào)控過程中也可能包含蛋白激酶/磷酸酶調(diào)控的大量功能蛋白磷酸化/去磷酸化過程。因此,我們將首先將完成這些已知的有代表性的蛋白激酶/磷酸酶小分子抑制劑的合成，同時并較為系統(tǒng)地分析已知的蛋白激酶或磷酸酶小分子抑制劑地結(jié)構(gòu)特點，找出

24、最常見的分子骨架，并以這些分子骨架為模板，通過不同的結(jié)構(gòu)修飾構(gòu)建較為系統(tǒng)的蛋白激酶和磷酸酶抑制劑小分子化合物庫（約10002000個化合物）。通過分析，我們發(fā)現(xiàn)已有的蛋白激酶小分子抑制劑在分子結(jié)構(gòu)上主要集中在以下幾種類型（圖四），因此，我們可以以這些分子骨架為基礎(chǔ)，對它們進行較為系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)改造,增強化合物的多樣性，構(gòu)建有針對性的蛋白激酶抑制劑類新型小分子庫。為干細胞自我更新和定向分化研究提供重要的小分子探針和研究工具。2. 調(diào)節(jié)和維持干細胞多能性的小分子化合物篩選和驗證平臺的建立胚胎干細胞擁有一個龐大而精確的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來維持其不分化狀態(tài)，目前 的研究成果在還不能充分解釋這個龐大的網(wǎng)絡(luò)。當傳統(tǒng)

25、分子生物學手段不能對如 此龐大的網(wǎng)絡(luò)進行有效率的研究時，最需要的就是利用交叉學科以及引入新的研 究方法和技術(shù)。所以我們計劃構(gòu)建針對干細胞多能性相關(guān)的不同信號通路的小分子化合物庫，為化學生物學方法研究干細胞多能性提供充足的研究對象。而穩(wěn)定 的、可以用于高通量篩選的細胞體系的建立和驗證平臺是對小分子化合物庫進行 篩選和確認的重要基礎(chǔ)條件。這方面我們將開展以下幾個方面的工作，來保障未 來相關(guān)工作的順利進行:1）建立穩(wěn)定的、可進行高通量篩選的干細胞模型:a）收集和建立基于形態(tài)學和基于報告基因的干細胞篩選體系：基于形態(tài)學的主要檢測指標包括干細胞形態(tài)檢測，干細胞多能性基因Oct4表達的檢測，重要標記物SS

26、EA1和AP的檢測。我們還會利用 Oct4 GFP的OG2轉(zhuǎn)基因鼠的干細胞可用于小分子化合物的篩選。因為這種細胞系具有的EGFP片段在18kb的Oct4的基因調(diào)控片段調(diào)控下表達 GFP，可以用來監(jiān)測多能性標記Oct4的表達情況，同時干細胞形態(tài)的變化與GFP 表達保持一致，這些指標可以用來作為小分子化合物調(diào)控干細胞自我更 新與分化的一個重要檢測指標。b）干細胞高通量篩選體系的優(yōu)化：化合物篩選過程中，對細胞的狀態(tài)要求 比較嚴格。細胞的狀態(tài)，密度，培養(yǎng)方式，培養(yǎng)條件均會影響篩選的結(jié) 果。如：在篩選過程中化合物會與培養(yǎng)基中的血清和其他細胞因子的成 分相互作用，影響篩選的效果和真實性。因此，干細胞培養(yǎng)體

27、系的優(yōu)化 和標準化對于小分子化合物的篩選十分重要。另干細胞是一種特殊的細胞，具有分化和自我更新的雙重功能。如鼠的干細胞需要依賴LIF （白 血病抑制因子）或Feeder （滋養(yǎng)層細胞）來維持其不分化的狀態(tài)。因此, 利用干細胞作為高通量篩選的載體研究小分子化合物對自我更新的影 響，需要設(shè)立較為可信的陰性和陽性對照條件和鑒定假陽性的標準，以獲得可信的篩選結(jié)果。我們已經(jīng)具備了一套完整的細胞形態(tài)/表面分子/特異基因表達等標準，來保證篩選過程中，陽性與陰性結(jié)果的確立。2）建立小分子化合物篩選結(jié)果的驗證與確證體系： 對于促進自我更新的小分子化合物來說，經(jīng)過篩選的細胞需要對其多能性標記進行檢測，并對EB形成

28、,畸胎瘤形成能力和嵌合鼠等方面進行一系列驗證，確認可以保持的干細胞的多能性和自我更新能力，且化合物在干細胞水平?jīng)]有致癌。致畸和致突變的作用。主要的技術(shù)手段包括分子生物學、細胞生物學和動物胚胎操作，我們在這方面的工作已經(jīng)積累了相當?shù)慕?jīng)驗。3）小分子化合物調(diào)節(jié)或維持干細胞自我更新能力的靶點、生物活性和調(diào)控機理：本項目中，我們會嘗試采用不同的方法來驗證化合物作用的靶點。其中c.包括：a.親和色譜法來驗證化合物作用的干細胞靶向蛋白。b.通過研究化合物對主要信號轉(zhuǎn)導通路上的基因表達的影響，鑒定出化合物作用的靶點。我們還可以通過采用小分子化合物探針篩選蛋白庫或結(jié)合cDNA和RNAi文庫來為找到化合物作用的

29、靶點。我們將進一步研究這些靶點，在干細胞自我更新調(diào)控網(wǎng)中的作用，發(fā)現(xiàn)一批能調(diào)控胚胎干細胞多能性的新基因、新的信號通路。如：靶蛋白在干細胞多能性相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑的存在形式，調(diào)控因素及功能等。因此這些靶蛋白的出現(xiàn)，將為干細胞多能性和自我更新機制的研究積累重要的研究線索。3. 干細胞體外定向分化的小分子化合物篩選平臺由于干細胞能被定向的誘導分化為生物體內(nèi)任一細胞類型，根據(jù)已有文獻報 道，小分子化合物可以誘導干細胞定向分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、 胰島細胞、脂肪細胞等。而干細胞向脂肪細胞定向分化是一個相對比較成熟的體 系,同時脂肪細胞具有明確的特異性的分子標記物， 我們將以干細胞向脂肪細胞

30、的定向分化作為研究切入點，建立影響其分化過程的細胞篩選平臺， 篩選能誘導 定向分化的活性小分子，并尋找其作用靶點，研究分化機理。具體研究方案如下:構(gòu)建分化細胞特異性基因-報告基因偶聯(lián)載體：我們擬分別將脂肪前體細胞特異的標志基 因 ALBP(adipocytelipid-binding protein， AP2)的啟動子(promotor)與新霉素抗性基因(Neomycin )融合，以及脂聯(lián)素(adiponectin )的啟動子與熒光素酶基因(luciferase )融合。利用前一報告載體，可通過新霉素抗性篩選，定性的檢測脂肪前體細胞的形成；利用后一報告載體，可通 過定量檢測熒光素酶的活性，定量

31、的檢測脂肪細胞的分化程度，從而篩選促進或抑制脂肪細胞終末分化的小分子化合物。構(gòu)建AP2-Neo和pAdiponectin-Luc AP2-Neo穩(wěn)定細胞株：將上述兩個報告基因載體轉(zhuǎn)染ES細胞，篩選獲得穩(wěn)定細胞株。將上述穩(wěn)定細胞株經(jīng)RA處理2-5天，檢測其新霉素抗性，從而驗證該細胞系用于進行脂肪前體細胞的篩選的可行性；再用分化培養(yǎng)液(胰島素)處理該前體細胞系，檢測其熒光素酶的表達強度，從而驗證該細胞系用于進行脂肪細胞的成熟分化的篩選的可行性。篩選促進或阻斷細胞定向分化過程的小分子：用RA作陽性對照，從構(gòu)建的RT-PCR，小分子化合物庫中篩選能誘導iPS細胞向脂肪前體細胞分化的小分子。首先通過報告

32、基因的檢測進行篩選，再結(jié)合形態(tài)學觀察、油紅染色、Western Blotting等技術(shù)手段進一步確認是否有脂肪細胞分化形成；以RA處理iPS細胞2-5天，待細胞成為脂肪前體細胞后，以分化培養(yǎng)液為陽性對照，從構(gòu)建的小分子化合物庫中篩選能誘導或抑制脂肪前體細胞向成熟脂肪分化的小分子。首先通過報告基因熒光素酶的檢測進行篩選，再結(jié)合形態(tài)學觀察、油紅染色、RT-PCR，Western Blotting等技術(shù)手段進一步確認是否有脂肪細胞分化形成。4）鑒定活性小分子的靶標：在獲得可以影響iPS細胞向脂肪細胞分化的小分子化合物后，為鑒定小分子的靶標，我們將根據(jù)該小分子的化學結(jié)構(gòu)將其共價偶聯(lián)于合適的固相載體上（

33、如瓊脂糖親和介質(zhì)），為避免非特異性吸附，同時將該小分子的無活性的類似物也偶聯(lián)在固相載體上，作為陰性選擇物。將前述陰性選擇物先與細胞裂解液結(jié)合，排除非特異性結(jié)合，然后將處理后的細胞裂解液與目標小分子進行親和結(jié)合，并最終通過質(zhì)譜方法鑒定與該小分子特異性結(jié)合的靶蛋白。4. 篩選對iPS有影響的小分子化合物，研究iPS的分子機理我們計劃建立多種篩選體系，篩選出能影響iPS形成效率和能激活iPS關(guān)鍵 基因的小分子化合物庫。期望最終能獲得若干能激活和促進重編程的小分子化合 物，尋找這些小分子的可能靶點，加速iPS機理的闡述，并力爭實現(xiàn)用化學方法對體細胞不做任何遺傳修飾就能將體細胞誘導到多能性狀態(tài)，這將是干

34、細胞研究 領(lǐng)域的重大突破，也將能為臨床應(yīng)用提供高效、安全的多能性干細胞。具體流程 如圖五所示:1）建立以堿性磷酸酶（AP） /Oct4-GFP為檢測標準的化合物篩選體系：建立以堿性磷酸酶（AP ）為檢測標準的化合物篩選體系，并用此驗證已知能夠部分激活細胞重編程或?qū)S持干細胞全能性有促進作用化合物的作用。利用建立好的AP檢測化合物篩選體系，從我們建好的化合物庫中尋找對4因子或3因子誘導iPS AP陽性克隆形成有促進或抑制作用的化合物。建立以0ct4-GFP為檢測標準的化合物篩選體系，從建好的化合物庫中尋找對4因子或3因子誘導iPS Oct4-GFP陽性克隆形成有促進或抑制作用的化合物。對用AP/

35、Oct4-GFP篩選體系中得到的對iPS形成效率有抑制作用的化合物進行機理研究，了解其產(chǎn)生作用的可能靶點，加速對iPS機理的闡述，促進選擇或設(shè)計針對此靶點的新化合物誘導iPS。2）建立Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc以及它們下游基因的啟動子報告基因篩選 體系：克隆Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc以及他們下游基因的啟動子到pWPI慢 病毒載體并鑒定。在NIH3T3，CRL-2097和IMR-90細胞中構(gòu)建整合各種報告基因的篩選用細胞模型。利用構(gòu)建好的帶有Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc以及它們下游基因的啟動子報告基因的穩(wěn)定細胞模型，對已有的化合物庫進行篩選，找出分別能激活

36、各個基因表達的化合物，并用 RT-PCR和WB鑒定。3）用篩選出的活性化合物，逐步替代Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子中的一種到幾種，最終實現(xiàn)完全用化合物高效誘導形成iPS :用篩選出的化合物替代其能激活的轉(zhuǎn)錄因子，與另外三種轉(zhuǎn)錄因子的病毒一起作用于MEF細胞，得到iPS細胞。用兩種篩選出的能分別替代一種轉(zhuǎn)錄因子的化合 物，與另外兩種種轉(zhuǎn)錄因子的病毒一起作用于MEF細胞，得到iPS細胞。用兩種篩選出的能共同作用替代兩種轉(zhuǎn)錄因子的化合物，加上能替代另一種轉(zhuǎn)錄因子的化合物，與剩下的一種轉(zhuǎn)錄因子的病毒一起，作用于MEF細胞，得到iPS細胞。用三種篩選出的能共同作用替代三種轉(zhuǎn)錄因子

37、的化合物，加上能替代剩下一種轉(zhuǎn)錄因子的化合物一起，作用于 MEF細胞，得到完全化合物誘導的iPS細胞。用四種篩選出的能共同作用替代四種轉(zhuǎn)錄因子的化合物，力卩上能提高iPS形成效率的化合物一起，作用于 MEF細胞，得到高效的完全化合 物誘導的iPS細胞。創(chuàng)新點和特色干細胞研究目前已成為發(fā)育與生殖領(lǐng)域研究的重點，為人類戰(zhàn)勝難治疾病、健康長壽地生活帶來了巨大的希望。干細胞不僅可以為再生醫(yī)學的替代治療提供 無限的細胞來源，還可以用于研究人類發(fā)育早期事件。而化學生物學作為新興的 交叉學科，利用化學手段，特別是小分子調(diào)節(jié)劑為蛋白質(zhì)功能研究提供了新的手 段。但是，采用化學生物學的策略，將小分子化合物用于干細

38、胞的自我更新、定向分化及體細胞重編程等方面的研究卻僅在近幾年才剛剛起步。我國有著豐富多 樣的天然化合物資源，如能及早開展小分子化合物在發(fā)育與生殖領(lǐng)域及干細胞誘 導、全能性維持和定向分化方面的研究和應(yīng)用， 必將使我國在上述領(lǐng)域的研究處 于國際前沿地位。本項目率先提出在我國建立能滿足發(fā)育與生殖領(lǐng)域基礎(chǔ)與應(yīng)用研究需求，特別是調(diào)控干細胞研究的小分子化合物與天然產(chǎn)物庫，以及相應(yīng)的合 成平臺、活性鑒定與篩選平臺，并制定相應(yīng)的硬件標準、技術(shù)指標、管理規(guī)范, 確保資源共享，以推進我國在小分子調(diào)控發(fā)育與生殖以及誘導干細胞領(lǐng)域的研 究?？尚行苑治鲆劳袉挝桓叨戎匾暠卷椖康纳暾埡托》肿诱{(diào)控干細胞方面的相關(guān)研究，并已

39、提供了很好的前期工作條件，包括場地、設(shè)備、人員和經(jīng)費支持等。本項目是在 已有工作基礎(chǔ)上的拓展和深入，研究內(nèi)容是在各實驗室工作基礎(chǔ)上提出的具有原 創(chuàng)性的內(nèi)容，前期的工作都已取得了一定的進展， 具有良好的工作基礎(chǔ)。相關(guān)的 實驗方案合理可行，實驗方法成熟，必需的實驗技術(shù)也已掌握，在技術(shù)上是完全 可行的。各學術(shù)骨干均有獨特的技術(shù)專長，涵蓋分子 /細胞生物學、發(fā)育生物學、有機化學、天然產(chǎn)物化學、藥物化學、生理學、藥理學等基礎(chǔ)學科，優(yōu)勢互補, 便于聯(lián)合攻關(guān)。各研究骨干在相應(yīng)領(lǐng)域均取得過國際領(lǐng)先的研究成果， 為本課題 的完成奠定了扎實的基礎(chǔ)。本項目的承擔單位具有高效的管理系統(tǒng)、專業(yè)的技術(shù) 支撐系統(tǒng)、優(yōu)秀的研

40、究生生源。項目參加人員長期以來得到了中科院、國家科技 部、自然科學基金委員會和地方政府等的大力支持，均能圓滿完成科研任務(wù)。上 述條件都將保證申請項目的順利實施和完成。課題設(shè)置 課題一：具有干細胞調(diào)控活性的天然產(chǎn)物的挑選和收集應(yīng)用化學信息和生物信息技術(shù)以及虛擬篩選等計算生物學方法，針對干細胞 誘導、多能性維持及定向分化等相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn) 能調(diào)控干細胞產(chǎn)生和分化的候選化合物；應(yīng)用天然產(chǎn)物分離提取方法獲得化合物 樣品，逐步建立具有干細胞調(diào)控前景的天然產(chǎn)物庫，為課題2提供篩選用化合物, 為課題4化合物合成提供線索。具體研究內(nèi)容:1. 建立化合物計算篩選平臺，包括完善基于蛋白

41、質(zhì)結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法，建立和完善天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫 CNPD (Chinese Natural Product Database)，建立干細胞誘導、多能性維持及定向分化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫SCRPD (StemCell Related P rotein Database）。2.應(yīng)用化學信息技術(shù)、的所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),生物信息技術(shù)和計算機虛擬篩選方法，針對SCRPD中搜尋CNPD數(shù)據(jù)庫，獲得具有調(diào)控干細胞形成或分化的天然產(chǎn)物信息。3.根據(jù)上述計算結(jié)果,收集天然產(chǎn)物樣品，這些樣品一部分來自課題組的長期部分從植物中分離提取獲得。承擔單位：中國科學院上海生命科學研究院，中國科學院昆明植物研究所 課題負責人：

42、劉東祥 經(jīng)費比例：12%課題二：干細胞調(diào)控相關(guān)的生物學模型的研究和建立胚胎干細胞的多能性維持、定向分化和體細胞重編程是干細胞研究的三個重 要科學問題，它們具體體現(xiàn)著多能干細胞與分化細胞之間關(guān)系的重要生命過程。胚胎干細胞擁有一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來維持其不分化狀態(tài)。在體外培養(yǎng) 條件下，ES細胞很容易產(chǎn)生自發(fā)式的分化，從而喪失其多能性，對基礎(chǔ)研究工作、胚胎干細胞的臨床運用帶來目前無法解決的一系列困難。因此需要對多能性 維持進行更深入的研究，才能設(shè)計出保證干細胞體外培養(yǎng)的系統(tǒng)； 而定向分化的 分子機理是臨床應(yīng)用研究中不可缺少的基礎(chǔ)；研究干細胞的重編程不僅可以更好 的了解多能性維持與分化狀態(tài)的分子

43、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還能直接運用到再生醫(yī)學研究, 并能在病人特異多能干細胞獲取方面有很大促進作用。我們將建立一系列穩(wěn)定 的、可以用于高通量篩選的細胞體系和驗證平臺，并對小分子化合物庫進行篩選和鑒定，然后用篩選得到的這些化合物對干細胞相關(guān)的自我更新、定向分化和重 編程（iPS）的機理進行研究。我們將開展以下三個方面的工作:1. 在已有的人、猴、小鼠的胚胎干細胞系培養(yǎng)技術(shù)平臺基礎(chǔ)上，按形態(tài)、表面 分子SSEA和核內(nèi)因子Oct4/Nanog表達來評價干細胞的多能性狀態(tài)，并以此建立維持干細胞多能性小分子化合物的篩選平臺。2. 以干細胞向脂肪細胞的定向分化作為研究切入點，建立影響其分化過程的細胞篩選平臺，篩選能誘

44、導定向分化的活性小分子，并尋找其作用靶點，研究定向分化的機理。3. 在病毒導入4個轉(zhuǎn)錄因子誘導iPS的基礎(chǔ)上，篩選對誘導效率有正向或負向 影響的小分子化合物；并以之逐步替代 4種轉(zhuǎn)錄因子中的1種到多種，最終實現(xiàn)完全用化合物高效誘導形成iPS。4.與課題三合作，開展高通量篩選。承擔單位：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，中國科學院上海生命科學研 究院 課題負責人：秦大江 經(jīng)費比例：12%課題三：干細胞調(diào)控相關(guān)的化合物庫建立及高通量篩選總體協(xié)調(diào)化合物庫的建設(shè)工作，負責樣品庫化合物的收集、購買和管理，建立一個存量為30000個化合物（其中3000個天然化合物由課題一負責收集,3000個活性化合物衍

45、生物由課題四負責合成）、可用于發(fā)育與生殖領(lǐng)域，特別是 干細胞誘導、多能性維持及定向分化相關(guān)研究的小分子化合物庫。 建立國家干細胞相關(guān)小分子化合物庫的網(wǎng)站和中心數(shù)據(jù)庫（包括化學及生物活性信息）、建立化合物庫的管理運行規(guī)范、建立合理的化合物資源共享機制。與課題二合作，將干細胞相關(guān)的化合物活性篩選模型高通量化，通過對化合物庫的篩選，為課題四的合成和結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造提供活性化合物。具體內(nèi)容:1.與課題一合作，通過文章、專利等檢索收集已有報道的、與干細胞誘導、增值及定向分化相關(guān)的小分子化合物信息（70 - 100個化合物），購買或合成（由課題四負責合成工作）這類化合物，為我國干細胞相關(guān)的研究工作提供標準化合

46、物。2.與課題一合作，應(yīng)用化學信息技術(shù)、生物信息技術(shù)和計算機虛擬篩選方法， 挑選20000個結(jié)構(gòu)新型、成藥性良好的小分子化合物，購買或收集這部分化合物用于干細胞相關(guān)的活性篩選。3.收集2000個中草藥的標準化組分用于干細胞相關(guān)的活性篩選。4.與課題二合作，將干細胞相關(guān)的化合物活性篩選模型高通量化，通過對化合 物庫的篩選，為課題四的合成和結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造提供活性化合物；同時也為國內(nèi)外的研究機構(gòu)提供篩選服務(wù)。5.承擔化合物庫管理工作，建立國家干細胞相關(guān)小分子化合物庫的網(wǎng)站和中心 數(shù)據(jù)庫（包括化學及生物活性信息）、建立化合物庫的管理運行規(guī)范、建立合理的化合物資源共享機制，為各研究機構(gòu)提供化合物或活性篩選

47、服務(wù)。承擔單位：中國科學院上海生命科學研究院課題負責人：謝欣經(jīng)費比例：60%課題四：具有干細胞調(diào)控活性的化合物及衍生物的合成建立有效的篩選模型，通過對化合物庫的高通量篩選是獲得可以調(diào)節(jié)復雜生命活動的小分子化合物的有效途徑。這種策略的有效性很大程度上依賴于化合物庫的質(zhì)量。我們首先將通過生物信息學及計算生物學尋找已知的可以調(diào)控胚胎干細胞自我更新和定向分化的小分子化合物的結(jié)構(gòu)特點， 并結(jié)合它們已經(jīng)證實或潛在的生物靶標的特點，保證它們在分子結(jié)構(gòu)的匹配性”將以這些已知小分子為基礎(chǔ)定向改造出的新化合物，或通過虛擬篩選獲得的可能與干細胞調(diào)控蛋白相互作用的小分子化合物組成一個新型小分子化合物庫用于干細胞調(diào)控活

48、性的篩選, 獲得活性化合物的幾率會非常大。1.針對已報道的可有效調(diào)控干細胞自我更新和定向分化的非商業(yè)化小分子化合物（約100個）開發(fā)有效的合成方法進行化學合成，為干細胞命運調(diào)控研究提供標準化合物。在此基礎(chǔ)上對這些化合物的結(jié)構(gòu)進行比較系統(tǒng)的多樣化改造，初步構(gòu)建一個約有30004000個小分子化合物的小型定向化合物庫。2. 我們還將針對在干細胞命運調(diào)控過程能夠發(fā)揮重要作用的一些關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子如Hedghog 信號通路、Notch信號通路、致死因子（Death receptor ）/NF B信號通路、Akt信號通路、Wnt信號通路和TGF生長因子信號通路等，定 向地以已經(jīng)報導的這些信號通路的小分子調(diào)節(jié)

49、劑為基礎(chǔ)，構(gòu)建它們導向性的小分子調(diào)節(jié)化合物庫（約5001000個化合物）。3. 與課題二和三合作，為篩選發(fā)現(xiàn)的活性化合物提供結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和改造。承擔單位：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、北京大學深圳研究生院 課題負責人：蔣晟 經(jīng)費比例：16%上述四個課題研究內(nèi)容各有側(cè)重，但有緊密結(jié)合，互相滲透融合（見圖六）。課題一著重建立化合物計算篩選平臺，包括完善基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方 法，建立和完善天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫 CNPD （Chi nese Natural P roduct Database），建立干細胞誘導、多能性維持及定向分化相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫SCRPD，用于天然化合物的挑選，也為課題三中

50、化合物的挑選和收購提供依據(jù)； 課題二著重 研究干細胞調(diào)控相關(guān)的生物學模型，包括定向分化、多能性維持及體細胞重編程 等，與課題三合作將模型高通量化，并對庫中的化合物進行活性篩選； 課題三主 要負責各類化合物的收購及化合物庫的管理， 包括課題一的天然化合物，課題四 的合成衍生物庫，也包括選購的具有結(jié)構(gòu)新穎性和良好成藥性的小分子化合物。建立合理共享模型，為各研究單位提供化合物或活性篩選服務(wù)。課題三也與課題二合作對庫中化合物進行高通量篩選；課題四一方面合成已有報道的活性化合 物，為化合物庫提供標準化合物，另一方面也對這類活性化合物或經(jīng)課題二、 篩選出來的活性化合物進行結(jié)構(gòu)修飾改造，進一步充實化合物庫。

51、四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標1、完善天然化合物數(shù)據(jù)庫1、完成針對5個干細胞調(diào)控相關(guān)的蛋(CNPD)；白質(zhì)結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法;圍繞與 MEK、Erk、p38、GSK3、2、建立與干細胞多能性維持、定向分ARF、GAP、Smo、Src、酪氨化相關(guān)的蛋白、信號通路及調(diào)控網(wǎng)酸蛋白激酶相關(guān)的蛋白質(zhì)建立絡(luò);與干細胞形成和分化相關(guān)的蛋3、建立干細胞自我更新、定向分化及白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò);體細胞重編程三個活性篩選平臺,建立穩(wěn)定的、可進行高通量篩選建立6-8種可用于高通量篩選的干的干細胞模型；采用不同的方法 細胞或分化細胞株，每個平臺擁有來驗證化合物作用的靶點;2-3種穩(wěn)定細胞株;對文獻報道具有干細胞調(diào)控活4、在

52、計算化學的輔助下挑選、收集性的70100個化合物開發(fā)有5000個小分子化合物（20 mg/個）效的合成方法并進行化學合成, 及750個天然產(chǎn)物（5 mg/個）；為干細胞命運調(diào)控研究提供標5、收集500個經(jīng)標準程序分離的中草藥組分;準化合物。通過前期建立的虛擬篩選平臺6、制定化合物庫管理細則及化合物共對大量天然產(chǎn)物及有機合成小 享機制及流程；建立化合物庫網(wǎng)站;分子進行篩選，尋找可能與干細7、完成2030個已知標準化合物的胞調(diào)控通路相關(guān)的化合物;合成工作，并提供100 mg樣品。建立化合物庫的管理方法及共以這些化合物為基礎(chǔ)，完成300享機制;400個小分子化合物庫的構(gòu)建，每對已合成的化合物進行比較

53、系 個化合物提供20 mg樣品;統(tǒng)的多樣化改造，初步構(gòu)建一個為1020家研究機構(gòu)提供標準化小型定向化合物庫。合物或提供化合物篩選服務(wù);8、為科研機構(gòu)提供化合物及篩選9、發(fā)表48篇SCI論文。服務(wù)。修正版研究內(nèi)容預(yù)期目標1、開發(fā)可以考慮靶標蛋白活性位1、完成考慮蛋白質(zhì)柔性的分子快速點殘基結(jié)構(gòu)柔性的高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)平臺;2、對接程序;完成天然化合物數(shù)據(jù)庫 CNPD ；繼續(xù)完善天然化合物庫CNPD ;3、發(fā)現(xiàn)25個能調(diào)控胚胎干細胞多建立與干細胞形成和分化相關(guān)能性的新基因或信號通路;的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫SCRPD ;4、在計算化學的輔助下挑選、收集繼續(xù)通過前期建立的虛擬篩選5000個小分子化合物（20 mg/個）平臺對大量天然產(chǎn)物及有機合 及750個天然產(chǎn)物（5 mg/個）；成小分子進行篩選，尋找可能與5、收集500個經(jīng)標準程序分離的中草干細胞調(diào)控通路相關(guān)的化合物;藥組分;研究并建立化學誘導干細胞的6、完善化合物庫管理細則及化合物共篩選體系;享機制及流程；完善化合物庫網(wǎng)利用建立的篩選平臺對庫中化站;合物進行篩選;7、建立以堿性磷酸酶（AP ）繼續(xù)對活性小分子化合物開發(fā)/Oct4-GFP為檢測標準的CiPS篩有效的合成方法并進行化學合選體系;成，為干細胞命運調(diào)控研