細(xì)胞分裂素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

1、細(xì)胞分裂素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展         11-04-23 14:50:00     作者：梁淵 趙美萍 劉虎威    編輯：studa20【摘要】  細(xì)胞分裂素是一類重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，對(duì)這類激素進(jìn)行超微定量檢測(cè)對(duì)于揭示其在植物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理、發(fā)揮其對(duì)作物生長(zhǎng)的調(diào)控作用具有重要意義。本文綜述了近年來(lái)細(xì)胞分裂素各種分析方法的研究進(jìn)展，包括免疫分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和電化學(xué)方法等，介紹了實(shí)際

2、樣品常用的前處理方法，并討論了未來(lái)的研究發(fā)展方向。 【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞分裂素，免疫分析法，色譜法，毛細(xì)管電泳法，樣品預(yù)處理，評(píng)述1 引 言細(xì)胞分裂素(cytokinins，CTKs)是一類重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，在植物體內(nèi)廣泛參與各種生物過(guò)程。CTKs可以促進(jìn)植物根部的形成，以及根部損傷的修復(fù)1。CTKs還影響葉綠體的制造和微結(jié)構(gòu)2，影響植物的光合作用和病原抵抗3等。目前, 已被確認(rèn)的CTKs有40余種4, 所有的天然CTKs都是腺嘌呤衍生物。表1列出了典型CTKs的結(jié)構(gòu)、名稱和簡(jiǎn)稱。根據(jù)其6位N原子(N6)上取代基(R1)的不同，常見(jiàn)的CTKs可分為3類: 異戊二烯型、異戊二烯衍生

3、型和芳香型4。同時(shí)，根據(jù)其R2的不同又可以將其分為自由堿基型、核苷型、葡萄糖苷型和核苷酸型等。另外還存在3位N原子或7位N原子上葡萄糖基取代的CTKs5。CTKs在植物體內(nèi)主要產(chǎn)生于RNA代謝過(guò)程6，生物學(xué)家已經(jīng)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)控制內(nèi)源CTKs的含量7，但是進(jìn)一步確定CTKs對(duì)植物生長(zhǎng)的作用還需要準(zhǔn)確的內(nèi)源性CTKs定量分析方法。另外，植物體內(nèi)的異戊烯基腺嘌呤(iP)等CTKs的濃度還可以作為反映植物生長(zhǎng)環(huán)境狀況和疾病情況的標(biāo)志物8。生物測(cè)試法(bioassays)是最早采用的CTKs測(cè)定方法9，但是這種方法的專一性和重復(fù)性都較差，分析過(guò)程復(fù)雜、工作量大，適合作為CTKs的定性分析

4、方法，為理化分析方法提供生物活性方面的依據(jù)。由于CTKs在植物體內(nèi)含量非常低(約為pmol/g)，因此，需要高靈敏度的定量分析方法和高選擇性的純化富集樣品前處理方法對(duì)其進(jìn)行分析。本文將從這兩方面進(jìn)行論述。2 分析方法2.1 免疫分析方法免疫分析方法具有高效液相色譜法(HPLC)等儀器分析方法所不及的優(yōu)勢(shì)及特點(diǎn)：(1) 由于免疫反應(yīng)的特異性，可用粗提產(chǎn)品直接檢測(cè)，從而顯著提高了測(cè)試速度;(2) 免疫分析對(duì)特殊儀器的需求較少，分析成本較低;(3) 免疫分析方法的靈敏度高。由于這些優(yōu)點(diǎn)，免疫分析方法一直在CTKs檢測(cè)中廣泛應(yīng)用1021。異戊烯基腺苷(iPR)和反式玉米素核苷(tZR)作為免疫分析研究

5、中的半抗原，所制得的抗體對(duì)N6上的取代基有較好的識(shí)別，即對(duì)于與半抗原R1不同的分子交叉反應(yīng)較小。最早用于CTKs測(cè)定的免疫分析方法是放射性標(biāo)記的免疫分析法(RIA)1013，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)iPR類10和ZR類11CTKs的定量檢測(cè)。其中Weiler等11制備的tZR抗血清對(duì)tZ和tZR有高特異性，對(duì)表1 典型細(xì)胞分裂素的結(jié)構(gòu)、名稱和簡(jiǎn)稱5, 40很小，對(duì)tZR的檢出限達(dá)到15 pg，線性范圍在0.0210 ng。該方法被用于西紅柿果實(shí)粗提物中玉米素含量的測(cè)定。Trione等12制備了抗tZR的單克隆抗體，并將其用于tZR的RIA檢測(cè)，靈敏度達(dá)到fmol量級(jí)。由于RIA需要專業(yè)的放射性物質(zhì)操作技術(shù)

6、以及特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，后來(lái)逐漸被更易普及和自動(dòng)化的酶免疫分析(EIA)所取代1421。Hansen等14利用抗tZR多抗以及堿性磷酸酯酶標(biāo)記抗原建立了對(duì)tZR和tZ的檢測(cè)方法，檢測(cè)線性范圍為0.330 pmol，同時(shí)利用這種方法測(cè)定了在玉米莖中tZR和tZ的梯度分布。Maldiney等15將生物素親和素體系引入ZR的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法，使得檢出限可以達(dá)到35 pg，線性范圍在11000 pg，利用這種技術(shù)可以檢測(cè)100 mg西紅柿樣品中的ZR含量。Zhao等16提出了一種簡(jiǎn)化的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，將抗體、競(jìng)爭(zhēng)分子和酶標(biāo)二抗在同一步中加入，可以縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)在一定程度上提高

7、了靈敏度(對(duì)ZR為1.3倍)，但該方法的試劑消耗量更大。由于CTKs都是小分子，因此在制備抗體時(shí)需先將CTKs與載體蛋白(如牛血清白蛋白(BSA)，雞卵白蛋白(OVA)等)偶聯(lián)制得全抗原。文獻(xiàn)1020中所采用的偶聯(lián)方法都是Erlanger等22建立的核苷類分子與蛋白分子上的自由氨基共價(jià)偶聯(lián)的方法(如圖1所示)。Papet等21研究了iPR與蛋白的另一種偶聯(lián)方法。ELISA和RIA的檢測(cè)結(jié)果表明，這種偶聯(lián)方法制得的多克隆抗體對(duì)iPR和iP具有專一性，與Z和ZR沒(méi)有交叉反應(yīng)。進(jìn)一步使用這種抗體制得免疫親和吸附膠，對(duì)iPR的吸附容量達(dá)到1 mg/L。圖1 嘌呤核苷與蛋白的偶聯(lián)方法22Fig.1 Co

8、njunction of adenosine to protein222.2 氣相色譜法(GC)由于CTKs分子揮發(fā)性較弱，無(wú)法直接用氣相色譜(GC)方法來(lái)分離檢測(cè)，所以對(duì)CTKs進(jìn)行GC分離檢測(cè)都需要先經(jīng)過(guò)衍生化2329。Most 等23首次報(bào)道了三甲基硅烷(TMS)衍生物用于CTKs的GC分離檢測(cè)。分別制備了iP、玉米素、二氫玉米素、激動(dòng)素及其相應(yīng)核苷的衍生物。制備方法為：將iP等化合物與雙(三甲基硅烷)乙酰胺(BTMSA)在60 的乙腈溶液中反應(yīng)5 min。衍生前樣品需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的干燥。雖然這種衍生方法比較簡(jiǎn)便，但由于在實(shí)際操作中難以控制N6上的取代反應(yīng)，影響了測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性。全甲基化

9、衍生技術(shù)由Morris24和Young25在1977年建立，首先用強(qiáng)堿對(duì)CTKs分子進(jìn)行處理，處理后的產(chǎn)物再與碘甲烷反應(yīng)。雖然這種衍生方法在操作上比TMS法要復(fù)雜，但它具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 全甲基化衍生物更穩(wěn)定，從而可以進(jìn)一步用HPLC或其它方法純化;(2) 形成的衍生物單一;(3) 甲基化后分子量只增加14，而TMS法增加72，分子量的大增使當(dāng)時(shí)的質(zhì)譜檢測(cè)方法受到限制。Morris等24通過(guò)對(duì)全甲基化衍生物的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，從長(zhǎng)春花的組織中首次檢出了天然的ZOG和ZROG。Young25對(duì)比了一系列強(qiáng)堿的衍生化效果發(fā)現(xiàn)，二甲亞砜碳負(fù)離子有很好的效果(二甲亞砜碳負(fù)離子由特丁基鋰加入二甲亞砜中制

10、得)。Ludewig等26報(bào)道了CTKs三氟乙酸衍生物的制備，這類衍生物由于具有很強(qiáng)的電子捕獲能力，可以被電子捕獲檢測(cè)器(ECD)高靈敏地檢測(cè)而被應(yīng)用。這種方法雖然靈敏度較好，但是衍生化時(shí)選擇性較差。Bjorkman等27比較了使用乙酸酐在不同溶劑、溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件下對(duì)CTKs類分子的乙基化結(jié)果，找到了一種簡(jiǎn)單、回收率高、副產(chǎn)物少的衍生化反應(yīng)條件，使用GCMS對(duì)衍生化CTKs的定量檢測(cè)可以達(dá)到pmol級(jí)的檢出限。這種方法的缺點(diǎn)是：R3為葡萄糖基的CTKs衍生化產(chǎn)物，在GCMS系統(tǒng)中不穩(wěn)定;玉米素類和二氫玉米素類CTKs的衍生物在EIMS譜圖中的分子離子峰很弱。因此，該方法不適于這兩類CTK

11、s中新型分子的鑒定。Birkemeyer等28使用N甲基N(特丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)對(duì)tZ、mT以及吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)等植物激素同時(shí)進(jìn)行衍生反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)用GCMS對(duì)多種植物激素的分離檢測(cè)，其中對(duì)tZ的檢出限達(dá)到0.9 pmol。作者采用這種方法對(duì)300 mg植物根部樣品以及秧苗樣品中的植物激素進(jìn)行了系統(tǒng)分析。2.3 高效液相色譜法(HPLC)對(duì)CTKs進(jìn)行定量分析的前提是各種CTKs的基線分離，液相色譜由于其強(qiáng)大的分離能力而在CTKs的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。HPLC方法的引入使CTKs的檢測(cè)水平有了巨大的突破，由于不同的C

12、TKs顯示出不同的極性，同時(shí)還具有穩(wěn)定的紫外吸收，利用HPLCUV法對(duì)CTKs進(jìn)行定量分析是最先報(bào)道的方法。使用最多的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LCMS)兼有LC的分離能力和MS的高靈敏度(尤其是MS/MS系統(tǒng))和高特異性3033, 同時(shí)MS信號(hào)還提供了被分析物的結(jié)構(gòu)信息，為尋找新型CTKs提供了有力的手段。最初嘗試對(duì)CTKs進(jìn)行分離的HPLC方法受到了柱填料的限制，后來(lái)非極性固相微粒材料的應(yīng)用使得HPLC成為了最有效的CTKs分離方法。1975年，Carnes等34成功對(duì)iP， Z及其核苷衍生物進(jìn)行了分離，分離速度達(dá)到了傳統(tǒng)LC的30倍。Stahly等35利用HPLC對(duì)桃、梨和蘋果樣品中的玉米素及

13、其核苷進(jìn)行了分離檢測(cè)。目前，電噴霧離子化(ESI)在CTKs的MS檢測(cè)中使用最為廣泛3743，Prinsen等37首次利用LCESIMS/MS的方法檢測(cè)了CTKs，建立了對(duì)16種不同CTKs的檢測(cè)方法，檢出限為1 pmol。他們還使用柱上濃縮的方法，在大體積進(jìn)樣的Micro LC和Capillary LC與MS/MS聯(lián)用上取得了更低的檢出限(在Micro LC上為5 fmol，在Capillary LC上為0.1 fmol)38。Novk等40報(bào)道了用ESI單四極桿質(zhì)譜定量檢測(cè)植物樣品中所有異戊二烯型CTKs的高靈敏度方法。方法中實(shí)現(xiàn)了20種非衍生的天然CTKs的基線分離。通過(guò)柱后分流，將反相

14、色譜柱的流出液同時(shí)引入DAD檢測(cè)器和MS檢測(cè)器。通過(guò)對(duì)最終流量，去溶劑化溫度、去溶劑化氣體和電壓等離子化參數(shù)的優(yōu)化，確定了ESI的最佳條件。所測(cè)CTKs都主要以分子離子峰M+H+的形式被檢測(cè)，檢測(cè)線性范圍為0.025(0.075)100 pmol，可以滿足常規(guī)檢測(cè)需要。在實(shí)際樣品的測(cè)定中，樣品提取液通過(guò)兩次不同的離子交換色譜純化，然后再通過(guò)一種基于CTKs單克隆抗體的親和免疫純化。LCMS對(duì)樣品中CTKs含量的測(cè)定結(jié)果還通過(guò)LC分離后的ELISA方法進(jìn)行了確證。研究結(jié)果表明，該方法可以滿足在生物樣品中異戊二烯型和異戊二烯衍生型CTKs的檢測(cè)要求，但由于缺乏同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，對(duì)于實(shí)際樣品中芳香型C

15、TKs的檢測(cè)還需要進(jìn)一步發(fā)展?？煸愚Z擊(FAB)離子源在CTKs檢測(cè)方面的應(yīng)用也有報(bào)道。Astot等44使用capLC/fritFABMS檢測(cè)了經(jīng)過(guò)柱前丙?；苌腃TKs，建立了選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)的定量方法。Tarkowska等39和Doleal等45采用這種方法分別發(fā)現(xiàn)了兩種新型的CTKs。柱前衍生法在LC分離CTKs中也有使用。不同類型的CTKs(如堿基型、核苷型、核苷酸型、葡萄糖苷型)的極性分布范圍非常廣，極性太大會(huì)影響待測(cè)物在柱上的分離以及流出峰的形狀。Nordstrolm等46研究了丙?；捅郊柞；瘜?duì)分離的影響。經(jīng)過(guò)衍生后的待測(cè)物極性降低，延長(zhǎng)了柱上的保留時(shí)間和ESI的信

16、號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于丙?；腪R及iPR檢出限達(dá)到約0.2 fmol，靈敏度有了較大提高。2.4 毛細(xì)管電泳法(CE)毛細(xì)管電泳是一種快速、高效、低進(jìn)樣量、易于自動(dòng)化的分離方法。通常，CE比HPLC的分析成本低、分析速度快。Pacakova等48將CZE和MEKC應(yīng)用于自由堿基型和核苷衍生型的CTKs的分離以及實(shí)際樣品的檢測(cè)。在150 mmol/L磷酸溶液體系中，pH 1.8條件下電滲流(EOF)可以忽略，各粒子間由于荷質(zhì)比的不同而分離，自由堿基型CTKs分子的淌度大于相應(yīng)的核苷衍生型。Bartk等49研究了各種環(huán)糊精(CD)添加劑對(duì)CE分離CTKs的影響。由于各種環(huán)糊精的內(nèi)部疏水腔以及CTKs分子各

17、部分尺寸的不同，使得環(huán)糊精能夠?qū)⒉煌珻TKs分子的淌度以不同程度減小。比如異戊二烯型和類異戊二烯型分子與CD作用較強(qiáng)，芳香型分子與CD作用較強(qiáng)。Liu等50采用了一種大體積進(jìn)樣的在線富集方法來(lái)提高CE檢測(cè)7種植物激素的靈敏度(包括激動(dòng)素(KT)和BAP)。通過(guò)這種方法可以對(duì)分析物實(shí)現(xiàn)10600倍的富集，使用UV檢測(cè)，對(duì)KT的檢出限達(dá)2.4 g/L。此方法的局限性是一次只能富集同一種電荷的分析物。Ge等采用了在線富集以及CEMS/MS聯(lián)用的方法，分別對(duì)6種核苷酸型CTKs51和12種不同類型的CTKs52進(jìn)行了分離檢測(cè)，檢出限均<0.2 mol/L，其中最低的DHZR檢出限為0.05 mo

18、l/L。Ge等53,54還建立了MEKCUV對(duì)各種CTKs的分離分析方法，可以對(duì)不同取代位置的Topolin異構(gòu)體及其核苷進(jìn)行分離。這幾種方法都用于經(jīng)固相萃取法(SPE)純化后的椰汁實(shí)際樣品的檢測(cè)。由于在MEKC方法中使用的表面活性劑能抑制離子化，可能污染離子源，給MEKC與MS的聯(lián)用帶來(lái)了困難。Ge等55進(jìn)一步發(fā)展了部分填充MEKC方法，表面活性劑的膠束溶液只在進(jìn)樣前后使用，有效地降低了表面活性劑對(duì)MS檢測(cè)的影響。2.5 其它分析方法CTKs中的CH具有電活性，在電極上會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)56，因此可以利用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。Hernandez等56利用懸掛汞滴富集tZ，分別用方波溶出極譜法和微分

19、脈沖溶出極譜法檢測(cè)tZ，檢出限達(dá)到15.5 g/L。他們還利用碳纖維超微電極檢測(cè)tZ，檢出限達(dá)到0.2 g/L57。這種超微電極有可能用于植物體內(nèi)CTKs的快速原位檢測(cè)。Li等58制作了一種基于安培測(cè)量的免疫傳感器。將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，K4Fe(CN)6和抗iPRIgG摻雜或吸附在玻碳電極表面的聚合物上，使用時(shí)利用已知濃度的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的iPR與未知濃度的iPR競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)量時(shí)葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，繼而在HRP催化下氧化K4Fe(CN)6，檢測(cè)K3Fe(CN)6還原時(shí)產(chǎn)生的電流即可間接反映出未知iPR的濃度。測(cè)量線性范圍為5300 mg/L，對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)量結(jié)果

20、與HPLC結(jié)果吻合。        3 樣品預(yù)處理方法由于生物樣品中CTKs的含量極低，而且生物樣品的組成復(fù)雜，所以對(duì)實(shí)際樣品中的CTKs進(jìn)行檢測(cè)時(shí)必須先將CTKs從樣品中提取出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分離和純化才能進(jìn)行檢測(cè)。目前，CTKs的檢測(cè)樣品一般為根、莖、葉和芽等部分的植物組織。這些組織樣品提取前需要先用液氮冷凍，然后研磨成粉末。3.1 提取劑甲醇、乙醇、高氯酸以及混合溶劑都可以用來(lái)提取CTKs。1964年，Bieleski59指出，植物體內(nèi)的磷酸酯酶會(huì)在很大溫度范圍內(nèi)的甲醇溶液中對(duì)核苷酸產(chǎn)生水解作用，因此在提取過(guò)程中應(yīng)當(dāng)

21、注意防止核苷酸型CTKs的水解。他們發(fā)現(xiàn)，加入了有機(jī)酸的溶劑在低溫下使用可使磷酸酯酶失活，從而抑制水解。Hoyerova等60的實(shí)驗(yàn)表明，加入甲酸確實(shí)對(duì)磷酸酯酶活性有很大抑制作用，同時(shí)，不含氯仿的Bieleski溶劑有利于提取后產(chǎn)物的進(jìn)一步處理以及后續(xù)分析。3.2 純化方法提取液的進(jìn)一步處理通常使用SPE或免疫親和純化法。用于CTKs純化的SPE法主要有離子交換柱44,45、C18柱41,42,4446和混合模式的Oasis MCX柱41,46,60，61，在實(shí)際應(yīng)用中通常將幾種方法結(jié)合使用。陽(yáng)離子交換柱可用來(lái)純化堿性的細(xì)胞分裂素，而陰離子交換柱適合純化酸性的細(xì)胞分裂素如核苷酸型細(xì)胞分裂素。Vreman等62提出了通過(guò)陽(yáng)離子交換純化CTK的方法。其具體步驟為：將水相提取液的pH調(diào)到3，使其流過(guò)已預(yù)先平衡至pH 3的銨型纖維素柱。用pH 3的水沖洗柱子后