注射用銀杏達莫（凍干）安全性實驗研究

1、注射用銀杏達莫（凍干）安全性實驗研究        【摘要】     目的對注射用銀杏達莫（凍干）進行肌肉刺激性、血管刺激性、豚鼠主動全身過敏反應(yīng)、大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)及溶血實驗，為其臨床應(yīng)用提供安全性實驗依據(jù)。方法肌肉刺激性實驗，觀察2只家兔注射用銀杏達莫（凍干）后48 h的變化。血管刺激性實驗，觀察連續(xù)用藥5 d注射用銀杏達莫（凍干）及生理鹽水，以及恢復14 d后的注射局部血管和周圍組織反應(yīng)情況。豚鼠主動全身過敏反應(yīng)，在第1次給藥后14 d及21 d，分別從足背

2、靜脈注射注射用銀杏達莫（凍干）觀察注射后15 min動物的過敏癥狀。大鼠被動皮膚過敏實驗，采用0.5%伊文思蘭溶液分析法。體外溶血實驗，觀察該品在3 h內(nèi)有無溶血和聚集現(xiàn)象。結(jié)果注射用銀杏達莫（凍干）對家兔股四頭肌、耳緣靜脈未見明顯刺激作用，對豚鼠主動全身過敏反應(yīng)及大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)均未見明顯過敏反應(yīng)；未見明顯體外溶血作用。結(jié)論注射用銀杏達莫（凍干）的安全性實驗結(jié)果提示其安全可靠。     【關(guān)鍵詞】  注射用銀杏達莫（凍干）； 安全性    Safety Evaluation of Yinxingda

3、mo (Freeze-dried Powder)SHEN Xiangchun，JIANG Fan, REN Fei，SHI Qin，PENG Jiao1. Research Division of Pharmacology, Guiyang Medical College, Guiyang, 550004, China;2. Drug Research and development Center of Guizhou Yibai Pharmaceutical Co., Ltd, Guiyang 550008, ChinaAbstract：ObjectiveTo evaluate the sa

4、fety of Yinxingdamo (Freeze-dried Power). Injected by testing the muscle stimulation, vessel stimulation, active systematic anaphylaxis, passive cutaneous anaphylaxis and haemolytic test.MethodsIn the muscle stimulation test, two rabbits were observed at 48 h after injection Yinxingdamo (Freeze-drie

5、d Power); In the vessel stimulation, four rabbits were observed on the 5 d after injection Yinxingdamo (Freeze-dried Power), and the reaction after stopped treatment 14 d. Active systematic anaphylaxis was investigated by male guinea pigs, reaction was observed the 14d and 21d after the first treatm

6、ent. The rat passive cutaneous anaphylaxis reaction was assayed by Evans blue. In the haemolytic test, hemolysis and coagulation were mainly observed. ResultsYinxingdamo (Freeze-dried power) injection had no stimulation to muscle and ear vein of rabbit, the guinea pigs and rats had no allergic react

7、ion as contrast and without hemolytic reaction.ConclusionYinxingdamo (Freeze-dried Power) injection is safe and reliable based on the animal experiment.Key words：Injected Yinxingdamo (Freeze-dried Power);  Safety evaluation    銀杏達莫注射液是貴州益佰制藥有限公司的拳頭產(chǎn)品，由銀杏葉提取物與適量雙密達莫精制而成,為中西藥復方制劑。銀

8、杏葉有效成分為:銀杏黃酮苷、銀杏苦內(nèi)酯、白果內(nèi)酯等,具有清除自由基,抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng),競爭性拮抗血小板活化因子,抑制蛋白激酶C ,降低細胞凋亡速度,修復損傷組織等作用1，2。加入小劑量雙密達莫后可進一步加強降低血液黏度,抑制血小板的活化和聚集,增強紅細胞變形能力及攜氧能力,臨床上用于動脈硬化、心腦血管疾病的防治。    由于中藥的液體制劑，無論是針劑還是口服制劑，都有可能在長時間放置后出現(xiàn)沉淀，從而導致不良反應(yīng)的產(chǎn)生，一般是因為氧化和溶劑的極性發(fā)生了改變造成的。凍干粉針劑的冷凍干燥在低溫下進行，物質(zhì)中的一些有效成分損失很小，而微生物的生長和酶的作用無法進行

9、，能保持原來的形狀；干燥后的物質(zhì)疏松多孔，呈海綿狀，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復原來的性狀。由于干燥在真空下進行，氧氣極少，因此一些易氧化的物質(zhì)得到了保護；干燥能排除95%99%以上的水分，使干燥后產(chǎn)品能長期保存而不致變質(zhì)。    基于凍干粉針劑的優(yōu)點與中藥注射液的缺陷，益佰藥物研究所為提高品種的質(zhì)量和臨床用藥的安全性，研制注射用銀杏達莫（凍干）。本次實驗評價益佰藥物研究所研制的注射用銀杏達莫（凍干）是否符合靜脈注射藥物的安全性標準,為其進入臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1  材料1.1  藥物與試劑注射用銀杏達莫（凍干），黃色凍干粉針劑，人用量

10、(25支溶于500 ml生理鹽水2次/d)貴州益佰醫(yī)藥有限公司，批號040805。卵蛋白，上海伯奧生物科技有限公司。百日咳菌苗，衛(wèi)生部上海生物制品廠研究所。伊文思蘭，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司。1.2  動物日本大耳白兔、SD大鼠、豚鼠等均由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2002-2001。2  方法2.1  藥物的配制    高劑量組：1支粉針劑溶于6 ml 0.9%的生理鹽水中，給藥容積為10 ml/kg。    低劑量組：1支粉針劑溶于12 ml 0.9%的生理鹽水中，給

11、藥容積為10ml/kg。    卵蛋白：臨用前用氯化鈉注射液配成0.5%濃度用于豚鼠腹腔注射，給藥容積為2 ml/kg。    激發(fā)給藥藥物配制：高劑量組：2支粉針劑溶于3 ml 0.9%的生理鹽水中，給藥容積為5 ml/kg；低劑量組：2支粉針劑溶于6 ml 0.9%的生理鹽水中，給藥容積為5 ml/kg。    低劑量組：1支粉針劑溶于6 ml 0.9%的生理鹽水中，給藥容積為10 ml/kg。2.2  肌肉刺激性實驗3取健康家兔2只，于本實驗環(huán)境下飼養(yǎng)1周，以熟悉實驗室條件。每只分別于一側(cè)

12、股四頭肌處以無菌操作方法注射，注射用銀杏達莫（凍干）溶液1 ml；另側(cè)相應(yīng)部位同法注射等容積滅菌生理鹽水作為對照。正常供應(yīng)飼料和水。48 h后放血處死家兔，解剖股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉的刺激反應(yīng)，按表1換算成相應(yīng)的反應(yīng)級分值。表1  肌肉刺激反應(yīng)分級標準（略）2.3  血管刺激性實驗4取健康成年家兔4只，耳緣靜脈注射藥物3 ml/只(右耳)，在對側(cè)耳注射生理鹽水3 ml/只做陰性對照(左耳)。連續(xù)用藥5 d。觀察給藥后不同時間注射局部血管和周圍組織反應(yīng)情況，如充血，水腫等。用藥周期根據(jù)藥物擬用于臨床的情況定。在第5天用藥后4896 h對動物和注射部位進行肉眼多次

13、觀察和檢查，處死2只動物，取注射部位血管和周圍組織進行組織病理學檢查。14 d后，處死另外2只動物，送病理檢查。2.4  豚鼠全身主動過敏反應(yīng)實驗3,5選擇體重300400 g的健康雄性豚鼠24只，按體重將豚鼠隨機分成4組（每組6只），即生理鹽水組、注射用銀杏達莫（凍干）高劑量組（臨床給藥劑量的10倍）與低劑量組（臨床給藥劑量5倍）和卵蛋白組。按注射劑過敏試驗要求，分別給豚鼠隔日腹腔注射配置的注射用銀杏達莫（凍干）、生理鹽水(10 ml/kg)和 0.5%卵蛋白0.5 ml，共3次。將每組內(nèi)分成兩批，分別在第1次給藥后14 d及21 d從足背靜脈注射注射用銀杏達莫（凍干）和生理鹽水(

14、5 ml/kg)和0.5%卵蛋白2 ml，注射后立即觀察有無過敏癥狀，如興奮不安、抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等癥狀，持續(xù)觀察3 h。按表2分級，判定其反應(yīng)級數(shù)。表2  豚鼠過敏反應(yīng)級數(shù)（略）2.5  被動皮膚過敏反應(yīng)實驗3，62.6  體外溶血實驗7取健康家兔1只，自心臟取血約20 ml，置于預(yù)先放有玻璃珠的三角瓶中，攪拌去纖維蛋白，然后將血移入刻度離心管內(nèi)，加入生理鹽水510 ml，混勻后離心5 min(2 0002 500 r/min)，去除上清液，再加生理鹽水混勻離心，反復洗34次，至上清液無色透明，將所得紅細胞按其容積用生理鹽水稀釋成2%的混

15、懸液。取試管7支，編號排列于試管架上，按表3加入各種溶液，第6管不加注射用銀杏達莫（凍干）藥液作為空白對照管；第7管不加藥液，用蒸餾水代替生理鹽水，作為溶血的陽性對照組，將各管輕輕搖勻，在37水浴中保溫3 h，開始每隔15 min觀察1次。1 h后，每隔1 h觀察1次，記錄3 h。表3  體外溶血實驗配比量（略）    全溶血：溶液澄明紅色，管底無細胞殘留。部分溶血：溶液澄明紅色或棕色，管底有少量紅細胞殘留。無溶血：紅細胞全部下沉，上層液體無色澄明。凝集：雖不溶血，但出現(xiàn)紅細胞凝集，振搖后不能分散。3  結(jié)果3.1  肌肉刺激性實驗注

16、射后不同時間觀察結(jié)果表明股四頭肌表面未見明顯充血，紅腫，家兔活動正常，未見明顯異常反應(yīng)。兩只家兔48 h后健康如常，解剖觀察股四頭肌，給藥部位均有輕度紅腫、充血等現(xiàn)象，評分1級。按照國家藥品食品監(jiān)督管理局新藥（中藥）研究辦法的要求，以上試驗結(jié)果提示，注射用銀杏達莫（凍干）未見明顯肌肉刺激性。3.2  血管刺激性實驗每天注射后觀察，雙側(cè)耳未見明顯充血水腫，注射后1 h內(nèi)，動物未見明顯異常反應(yīng)。病理組織學檢查結(jié)果提示：給藥結(jié)束左耳鱗狀上皮無增生、萎縮，上皮下無充血、水腫及炎癥；除1只動物右耳有輕微炎癥反應(yīng)發(fā)生，其余未見明顯炎癥反應(yīng)?；謴?4 d后各動物左右耳均未見血管擴張和炎細胞浸潤。本

17、品對家兔血管未見刺激性。3.3  豚鼠全身主動過敏反應(yīng)實驗注射用銀杏達莫（凍干）組與生理鹽水組兩批豚鼠分別于第1次給藥后14 d及21 d，由足背靜脈注射注射用銀杏達莫（凍干）或生理鹽水5 ml/kg，注射后豚鼠均未出現(xiàn)興奮不安、呼吸困難、抓鼻、顫抖、豎毛、痙攣、抽搐、大小便失禁、休克死亡等過敏反應(yīng)，判定為0級，提示注射用銀杏達莫（凍干）未見全身主動過敏反應(yīng)；而陽性組卵蛋白組兩批豚鼠分別于第1次給藥后14 d及21 d，足背靜脈注射0.5卵蛋白 2 ml，注射后兩批豚鼠在5 min內(nèi)均出現(xiàn)興奮不安、呼吸困難、抓鼻、顫抖、豎毛、痙攣、抽搐、大小便失禁、休克死亡等過敏反應(yīng)，判定為4級。3

18、.4  大鼠同種被動皮膚過敏反應(yīng)實驗注射用銀杏達莫（凍干）組生理鹽水組大鼠背部皮膚均未見明顯藍色反應(yīng)斑點。而卵蛋白組8只大鼠背部15，110注射點均出現(xiàn)明顯藍色反應(yīng)斑。結(jié)果表明，注射用銀杏達莫（凍干）未見明顯同種被動皮膚致敏作用。3.5  體外溶血實驗第7管（陽性對照管）溶液呈現(xiàn)澄明紅色，其余6管均末見澄明紅色，紅細胞全部下沉，上層液體無色澄明。表明注射用銀杏達莫（凍干）未見明顯體外溶血作用。結(jié)果見表4。提示注射用銀杏達莫（凍干）無溶血和凝集反應(yīng)。表4  不同時間點溶血實驗結(jié)果（略）4  討論    藥物刺激性、過敏性、溶血

19、性是指藥物制劑經(jīng)眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動脈、肌肉、皮下、靜脈旁和鞘內(nèi)等非口服途徑給藥,對用藥局部產(chǎn)生的毒性(如刺激性和過敏性等)和/或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性(如過敏性、溶血性等),它是臨床前安全性評價的重要組成部分。藥物的活性成分及其代謝物、輔料、有關(guān)物質(zhì)及理化性質(zhì)(如pH 值、滲透壓等) 均有可能引起刺激性和/或過敏性和/或溶血性和/或熱原反應(yīng)的發(fā)生,而嚴重的毒性可以影響用藥的安全有效性,因此藥物在臨床應(yīng)用前應(yīng)該研究其制劑在給藥部位使用后引起的局部和/或全身毒性,以提示臨床應(yīng)用時可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、毒性靶器官、安全范圍、臨床研究監(jiān)測指標并為臨床解毒或解救措施提供參考,保障臨床用藥的安全有效。綜合考慮以上各實驗的結(jié)果，以便為藥物的臨床研究與應(yīng)用提供一定的藥物毒理學基礎(chǔ)。    本次實驗的受試藥物注射用銀杏達莫