黃連內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)條件篩選

1、黃連內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)條件篩選摘要：本試驗(yàn)采用壓貼法通過(guò)對(duì)黃連根、莖、葉在不同次氯酸鈉濃度及不同表面消毒時(shí)間的PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)，選出黃連內(nèi)生真菌的適宜培養(yǎng)條件；在獲得適宜培養(yǎng)條件后重新培養(yǎng)所有部位，待其長(zhǎng)菌后挑選菌落邊緣菌絲再培養(yǎng)，如此反復(fù)，直到獲得純培養(yǎng)物為止。通過(guò)培養(yǎng)篩選在主根、須根、葉柄、葉片四個(gè)部位共獲得了60多種菌株，并對(duì)分離出的菌株進(jìn)行保種，為后續(xù)的菌株鑒定、菌株抗菌活性的測(cè)定做準(zhǔn)備。關(guān)鍵詞：黃連，內(nèi)生真菌，分離條件，培養(yǎng)條件Endophytic fungi of Coptis separation and culture conditions screeningAbstract

2、: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising suitable cultivation

3、,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is preparation for subsequent strain

4、s of identification, the determination of strains antimicrobial activity.Keywords: Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions黃連（Coptis chinensis Franch）是我國(guó)名貴中藥材之一，含有大量的異喹啉類(lèi)生物堿1（小蘗堿、黃連堿、甲基黃連堿、小蘗紅堿、藥根堿、阿魏酸等）。尤其是小蘗堿對(duì)人體病原細(xì)菌和皮膚真菌2具有廣譜的抗菌活性，在醫(yī)藥中被廣泛應(yīng)用；同樣，小蘗堿對(duì)許多植物病原真菌和細(xì)菌也有顯著的抑制作用。Hi

5、rano, H.等用硫酸小蘗堿處理大麥種子減輕了大麥條紋花葉病毒病（BBMV）的發(fā)生3。黃連的藥理研究主要以小蘗堿和黃連解毒湯為重點(diǎn)，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）4、鎮(zhèn)靜作用、止瀉作用、健胃作用5、對(duì)心臟心率6和心律作用等7。黃連及復(fù)方臨床應(yīng)用常用于治療痢疾、急性腸胃炎、慢性腹瀉、呼吸道感染、白喉、百日咳、結(jié)核性胞膜炎、萎縮性鼻炎、流行性結(jié)膜炎、化膿性中耳炎、口瘡、牙周炎、萎縮性胃炎、胃炎、胃及十二指腸潰瘍、慢性膽囊炎等，近年來(lái)還研究發(fā)現(xiàn)黃蓮具有較強(qiáng)的抗癌和降血糖功效。黃連藥效作用廣泛，歷來(lái)為醫(yī)家常用藥材，而無(wú)節(jié)制的開(kāi)放，野生資源已經(jīng)枯竭，黃連栽培條件苛刻，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，難以滿(mǎn)足醫(yī)藥生產(chǎn)

6、的需要8。因此迫切需要尋找開(kāi)發(fā)新的資源。大量的研究發(fā)現(xiàn)9, 10，內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，是新化合物、新藥物的潛在資源。開(kāi)發(fā)和利用植物內(nèi)生真菌在保護(hù)植物物種資源、探索新的產(chǎn)物和新的活性以及提高活性成分的生產(chǎn)效率等方面都具有重要的價(jià)值。從目前已經(jīng)研究過(guò)的植物來(lái)看，未發(fā)現(xiàn)沒(méi)有分離到內(nèi)生真菌的，因此可以推斷出內(nèi)生真菌在植物內(nèi)是普遍存在的。內(nèi)生真菌-植物共生體11能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，用來(lái)抵御自然界的蟲(chóng)害，吸引有益微生物和傳粉者，競(jìng)爭(zhēng)陽(yáng)光和營(yíng)養(yǎng)等。內(nèi)生真菌在植物體與外界環(huán)境的交流中發(fā)揮著重要的作用，為了增加對(duì)病原微生物的抵抗，他們產(chǎn)生新的抗菌素12，這些抗菌素具有環(huán)保，高

7、效的特征，是新抗菌素的主要來(lái)源，也是生物控制的一個(gè)重要手段。將有益的內(nèi)生真菌接種于藥用植物無(wú)菌苗的體內(nèi)，能夠縮短組織培養(yǎng)周期，對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝進(jìn)行綜合調(diào)節(jié)，促進(jìn)宿主藥用植物活性成分的合成和積累，提高有效成分的含量。此外，還可以將有益的內(nèi)生真菌進(jìn)行合理的優(yōu)化組合，獲得相應(yīng)的“內(nèi)生真菌集群”13。目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)對(duì)黃連內(nèi)生真菌研究的報(bào)道，故筆者預(yù)研究我國(guó)黃連主產(chǎn)區(qū)重慶石柱的黃連的內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)條件及菌株保存，為尋找含有與黃連相似或相同化合物的菌株打下基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料新鮮無(wú)可見(jiàn)病斑的石柱黃連（C. chinensis Franch）的主根、須根、葉柄、葉片。1.2 試

8、驗(yàn)試劑青霉素；硫酸鏈霉素；75%乙醇；次氯酸鈉溶液（9%、4.5%、2.25%）（濃度以有效氯含量計(jì)）；1.3 培養(yǎng)基的配置PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂；不同濃度PDA雙抗培養(yǎng)基：以馬鈴薯20%、葡萄糖2%為基礎(chǔ)，分別稀釋為12.5%、25%、50%、75%、100%后，再加入瓊脂2%，滅菌后稍加冷卻，然后加入120ug/mL青霉素和100ug/mL硫黃霉素。1.4 儀器設(shè)備托盤(pán)天平、燒杯、量筒、剪刀、培養(yǎng)皿、注射器、酒精燈、鑷子電熱蒸餾水器：WS2-226-77 HSZ11-5型，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠(chǎng)電子萬(wàn)用爐：220VAC 1000W 天津泰斯特儀器有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干

9、燥箱：DHG-9108A型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：LDZX-40SAI型，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)安泰公司制造電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9082，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司光照培養(yǎng)箱：MGC-250，上海一恒公司1.4 試驗(yàn)方法1.4.1 表面滅菌方法篩選自來(lái)水將整株黃連徹底沖洗干凈晾干后，分別取下主根、須根、葉柄、葉片，切割成較大的塊，再按下面的方法對(duì)試驗(yàn)組及對(duì)照組進(jìn)行處理：CK1：無(wú)菌操作的全過(guò)程中將5皿打開(kāi)蓋子的PDA的培養(yǎng)皿放于超凈工作臺(tái)。在試驗(yàn)組處理完后以相同方式培養(yǎng)。CK2：取適量最后一次漂洗液涂布于PDA培養(yǎng)基中，涂布2皿

10、CK3：取材料壓入PDA培養(yǎng)基中，待0.5h后取出材料，重復(fù)10次。主根：在75%乙醇中處理40 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三種濃度的次氯酸鈉溶液中分別處理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；葉柄：在75%乙醇中處理30 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三種濃度的次氯酸鈉溶液中分別處理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；葉片：在75%乙醇中處理20 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三種濃度的次氯酸鈉溶液中分別處理1 min、3 min、5 min；須根：在75%乙醇中處理10 s，然后放入9%、4.5%、2.25%三種

11、濃度的次氯酸鈉溶液中分別處理0.5 min、1 min、3 min； 將經(jīng)過(guò)以上消毒處理的材料材料接種于PDA培養(yǎng)基中，重復(fù)10次。置于25中培養(yǎng)，未接種材料的皿培養(yǎng)7天后觀察是否有菌長(zhǎng)出。接種材料的皿觀察菌長(zhǎng)出的時(shí)間，生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)出菌量。1.4.2 分離培養(yǎng)條件篩選將黃連的主根、須根、葉柄、葉片以前面篩選出的表面消毒時(shí)間處理后，接種于不同濃度PDA培養(yǎng)基中，分別于15、25的培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)。各材料接種20皿，每變量放置2皿。觀察生長(zhǎng)出真菌的時(shí)間、生長(zhǎng)出的數(shù)量、生長(zhǎng)速度。1.4.3 內(nèi)生真菌的分離純化培養(yǎng)7天后取各個(gè)菌落邊緣的菌塊接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4天后再次取菌落邊緣菌絲接種，如此

12、反復(fù)多次，直到獲得純培養(yǎng)物為止。1.4.4 保種用水浴保種的方法對(duì)純化所得的菌株進(jìn)行保種。用滅菌的大頭針挑取純化的菌落的一部分，放入1.5mL的無(wú)菌EP管中，加入無(wú)菌水至淹沒(méi)菌種，密封保存。2 結(jié)果與分析2.1 表面消毒條件篩選2.1.1 主根表面消毒的篩選表1 主根在次氯酸鈉各濃度不同時(shí)間表面消毒后長(zhǎng)菌率Table 1 The percentage of growing fungi on root at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸鈉濃度（%）次氯酸鈉時(shí)間

13、（min）第4日長(zhǎng)菌率（%）第7日長(zhǎng)菌率（%）第10日長(zhǎng)菌率（%）對(duì)照是否長(zhǎng)菌96175083-8000-10000-4.520100100-402090-603383-8408080-1001717-2.25220100100+4060100+6173367+8336783+1033100100+注：“-”表示未長(zhǎng)菌，“+”表示長(zhǎng)菌，下同。通過(guò)表1數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)在次氯酸鈉濃度為2.25%時(shí)，對(duì)照組有菌長(zhǎng)出，說(shuō)明濃度過(guò)低；在濃度為9%時(shí)，對(duì)照組未長(zhǎng)菌，但試驗(yàn)組幾乎無(wú)菌長(zhǎng)出，表明濃度過(guò)高；在濃度為4.45時(shí)，比較發(fā)現(xiàn)4min、6min的消毒時(shí)間為最佳時(shí)間，故選擇次氯酸鈉濃度為4.5%和消毒時(shí)間4m

14、in作為最佳篩選條件，既達(dá)到消毒水平也最節(jié)約時(shí)間。2.1.2 須根表面消毒的篩選表2 須根在次氯酸鈉各濃度不同時(shí)間表面消毒后長(zhǎng)菌率Table 2 The percentage of growing fungi on fibrous root at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸鈉濃度（%）次氯酸鈉時(shí)間（min）第4日長(zhǎng)菌率（%）第7日長(zhǎng)菌率（%）第10日長(zhǎng)菌率（%）對(duì)照是否長(zhǎng)菌90.5132550-1132550-3132525-4.50.55075100-1

15、387588-30013-2.250.5387588+1387563-3388863+對(duì)表2數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：在次氯酸鈉濃度為2.25%時(shí)，對(duì)照組不僅有真菌長(zhǎng)出還有細(xì)菌長(zhǎng)出，說(shuō)明濃度太低；在濃度為9%時(shí)，對(duì)照組未長(zhǎng)菌，但試驗(yàn)組的長(zhǎng)菌率只有50%，偏小不適合；在濃度為4.5%時(shí)，0.5min、1min的消毒時(shí)間較好，考慮試驗(yàn)過(guò)程的方便性，選擇消毒時(shí)間1min為最佳時(shí)間，故須根的表面消毒篩選條件為：在4.5%的次氯酸鈉中1min。2.1.3 葉柄表面消毒時(shí)間的篩選表3 葉柄在次氯酸鈉各濃度不同時(shí)間表面消毒后長(zhǎng)菌率Table 3 The percentage of growing fungi on pe

16、tiole at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸鈉濃度（%）次氯酸鈉時(shí)間（min）第4日長(zhǎng)菌率（%）第7日長(zhǎng)菌率（%）第10日長(zhǎng)菌率（%）對(duì)照是否長(zhǎng)菌96303060-810200-104030104.565040100-87070100-10101050-2.2566090100-8100100100-10100100100-從表3數(shù)據(jù)也可看出在次氯酸鈉濃度為2.25%時(shí)，對(duì)照組已沒(méi)有菌長(zhǎng)出，比較分析選擇消毒時(shí)間6min作為最佳條件，因此葉柄的表面消毒篩選條

17、件為：在2.25%的次氯酸鈉中6min。2.1.4 葉片表面消毒的篩選表4 葉柄在次氯酸鈉各濃度不同時(shí)間表面消毒后長(zhǎng)菌率Table 4 The percentage of growing fungi on leaves at different times of the surface concentration in sodium hypochlorite disinfecting次氯酸鈉濃度（%）次氯酸鈉時(shí)間（min）第4日長(zhǎng)菌率（%）第7日長(zhǎng)菌率（%）第10日長(zhǎng)菌率（%）對(duì)照是否長(zhǎng)菌91205070-304060-502040-4.515070100-33080100-5406080-2

18、.2515080100+35080100+55070100+觀察表4數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，在次氯酸鈉濃度2.25%時(shí)，對(duì)照組有菌長(zhǎng)出，說(shuō)明消毒濃度不夠；在次氯酸鈉濃度4.5%及9%時(shí)，對(duì)照組都無(wú)菌長(zhǎng)出，對(duì)比發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉濃度4.5%且3min時(shí)最適宜葉柄的表面消毒。2.2 培養(yǎng)條件的篩選表5 對(duì)培養(yǎng)條件的篩選Table 5 Screening of culture conditions溫度（）PDA濃度（%）4天后7天后10天后1512.5無(wú)菌長(zhǎng)出開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)緩慢25無(wú)菌長(zhǎng)出開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)緩慢50無(wú)菌長(zhǎng)出開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)緩慢75無(wú)菌長(zhǎng)出開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)緩慢100開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)緩慢長(zhǎng)勢(shì)緩慢2512.5無(wú)菌長(zhǎng)出長(zhǎng)勢(shì)緩慢長(zhǎng)

19、勢(shì)良好25無(wú)菌長(zhǎng)出長(zhǎng)勢(shì)緩慢長(zhǎng)勢(shì)良好50開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)良好生長(zhǎng)旺盛75開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)良好生長(zhǎng)旺盛100開(kāi)始長(zhǎng)菌長(zhǎng)勢(shì)良好生長(zhǎng)旺盛注：從得到的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)部位的溫度濃度培養(yǎng)結(jié)果基本一致，故在此只列出一個(gè)表格說(shuō)明。各部分材料在前面篩選出的表面消毒時(shí)間處理后，接種于PDA雙抗培養(yǎng)基，試驗(yàn)中選擇了15、25兩個(gè)溫度條件進(jìn)行培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)它們都在25時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較好，因此最后的培養(yǎng)條件選擇25進(jìn)行培養(yǎng)。在對(duì)不同濃度的PDA培養(yǎng)基選擇時(shí)發(fā)現(xiàn)常規(guī)培養(yǎng)基能使黃連內(nèi)生真菌很好生長(zhǎng)，因此培養(yǎng)基還是按照100%配置。2.3 菌株的分離及保種按照上述試驗(yàn)結(jié)果獲得的最佳表面滅菌、最佳培養(yǎng)條件重新接種一批材料。7天后，用接種環(huán)挑取

20、各個(gè)菌落邊緣的菌絲接種于雙抗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4天后再次挑取邊緣菌絲接種，經(jīng)過(guò)多次反復(fù)的培養(yǎng)最后從主根分離出14種，須根7種，葉柄24種，葉片21種共60多種菌株。在最后一次的培養(yǎng)基上用滅菌的大頭針挑取純化的菌落的一部分，放入1.5mL的EP管中，加入無(wú)菌水至淹沒(méi)菌種，密封保存。3 討論本試驗(yàn)是首次對(duì)黃連的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，但在禾本科植物中分離內(nèi)生真菌的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)廣泛11, 14，技術(shù)比較成熟，具有借鑒作用。通過(guò)試驗(yàn)獲得了適宜黃連各部位表面消毒和培養(yǎng)的條件，為今后黃連藥物的研究能夠提供一些幫助。從表14的結(jié)果分析可看出除葉柄外，其他部位消毒濃度都在4.5%達(dá)到最佳效果，原因可能是黃連葉柄表面

21、十分光滑且有木質(zhì)部的存在，使得表面附著的真菌、細(xì)菌難以生長(zhǎng)，從而在2.25%時(shí)就能打到最佳效果。由于都是同一植株的內(nèi)生真菌，他們對(duì)培養(yǎng)的條件要求幾乎一致，在常規(guī)的PDA培養(yǎng)基和室溫條件能很好的生長(zhǎng)。植物體內(nèi)不僅僅含有真菌，同時(shí)還含有細(xì)菌，因此在最后的分離時(shí)選擇了加入青霉素和硫酸鏈霉素的雙抗PDA培養(yǎng)基來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)15，從而更好的分離真菌。分離后保種的菌株能夠?yàn)楹罄m(xù)的菌株鑒定、菌株抗菌活性的測(cè)定做準(zhǔn)備。4 結(jié)論主根的最佳表面消毒時(shí)間為75%乙醇溶液洗滌40 s，4.5%的次氯酸鈉溶液4 min；葉柄的最佳表面消毒時(shí)間為75%乙醇溶液洗滌30 s，2.25%的次氯酸鈉溶液6 min；葉片的最佳

22、表面消毒時(shí)間為75%乙醇溶液洗滌20 s，4.5%的次氯酸鈉溶液3 min；須根的最佳表面消毒時(shí)間為75%乙醇溶液洗滌10 s，2.25%的次氯酸鈉溶液1 min。最佳分離培養(yǎng)條件為25，100%濃度的雙抗PDA培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)1 邵順波. 異喹啉類(lèi)生物堿的生理活性及研究進(jìn)展J. 安徽醫(yī)藥. 2007, 11(003): 254-255.2 肖平. 黃連的藥理作用與臨床應(yīng)用J. 中華綜合臨床醫(yī)學(xué)雜志 (北京). 2004, 6(006): 142-143.3 Hirano H, Osawa E, Yamaoka Y et al. Gastric-mucous membrane protection activity of coptisine derivativesJ. Biol Pharm Bull. 2001, 24(11): 1277-1281.4 陳群, 陳南菊. 黃連對(duì)大腸桿菌 R 質(zhì)粒消除作用的試驗(yàn)研究J. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志. 1996, 16(001): 37-38.5 秦彩玲, 劉君英. 黃連湯對(duì)試