人核遷移蛋白單克隆抗體的制備及其在人巨核細(xì)胞中的表達(dá)

1、人核遷移蛋白單克隆抗體的制備及其在人巨核細(xì)胞中的表達(dá)         11-01-30 14:21:00     作者：陳彥球, 葛怡琛,     編輯：studa20【摘要】  目的: 制備人核遷移蛋白（hNudC )的單克隆抗體（mAb）并鑒定其特性。方法: 從人胎肝組織中克隆得到 hNudC 基因, 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28b/hNudC, 表達(dá)帶有6His標(biāo)記的重組hNudC, 用純化的重組 hNudC 蛋白免疫

2、BALB/c小鼠制備mAb, 用ELISA篩選抗體陽性的細(xì)胞克隆, 用免疫熒光染色法及Western blot 試驗(yàn)鑒定 mAb 的特異性。結(jié)果: 獲得2株雜交瘤細(xì)胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亞類(型)分別為IgG1 和IgM() , 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的ELISA效價(jià)分別為164和132; 腹水mAb的效價(jià)分別為11×105和15×104。mAb與重組hNudC蛋白有較強(qiáng)的特異性反應(yīng), 免疫熒光染色和Western blot試驗(yàn)證明, 制備的 mAb 可以識別人巨核系白血病細(xì)胞株 Dami、 Meg01和人臍帶血來源的CD41巨核細(xì)胞中表達(dá)的 hNudC

3、 蛋白。結(jié)論: 成功地制備了特異性抗 hNudC mAb, 為研究 hNudC 蛋白的功能、 天然分布及異常表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  人核遷移蛋白; 單克隆抗體; 巨核細(xì)胞    人核遷移蛋白C 基因(human nuclear distribution C, hNudC), 定位于第1號染色體1p34p35,   編碼331個(gè)氨基酸, 基因全長為8 kb。NudC進(jìn)化上保守, 從構(gòu)巢曲霉、 果蠅、 小鼠等生物均能找到同源物, 人類 NudC羧基末端的94個(gè)氨基酸與構(gòu)巢曲霉的同源性為67%, 與果蠅的同源性為76%, 與大鼠的同

4、源性為98%。NudC的C末端12個(gè)氨基酸, 在所有的種類中都被保留1。hNudC在人體組織中廣泛表達(dá), 提示hNudC具有重要的生物學(xué)功能2。早期的生物學(xué)活性的研究表明, hNudC與其家族成員(包括胞質(zhì)動力蛋白、 肌動蛋白、 LIS1和NUDE)相互作用, 和微管一起參與細(xì)胞增殖3、 正常的造血4、 神經(jīng)細(xì)胞形成等。近期研究進(jìn)一步證明, hNudC在促進(jìn)造血細(xì)胞生長中起著功能性作用5。這些資料為 hNudC的功能研究提供了新的方向。    為了進(jìn)一步研究hNudC蛋白的結(jié)構(gòu)與功能, 探索hNudC對于造血細(xì)胞的增殖、 分裂的功能和影響, 迫切需要hNudC的特

5、異性抗體, 但現(xiàn)在并無相應(yīng)市售抗體。為此, 本研究擬用純化的重組hNudC蛋白為免疫原, 利用經(jīng)典的淋巴細(xì)胞融合技術(shù), 建立穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株, 并對得到的mAb進(jìn)行鑒定, 檢測hNudC蛋白在人巨核細(xì)胞中的表達(dá)情況和亞細(xì)胞定位, 為進(jìn)一步探討hNudC蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供工具。    1  材料和方法    1.1  材料  弗氏完全佐劑購于Sigma公司。蛋白表達(dá)載體pET28b(+) 購自Invitrogen公司; 工具酶購自MBI Fermentas公司; 質(zhì)粒DNA

6、提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自O(shè)mega公司;  親和層析柱TALON Spin Column購自CLONTECH公司;  Dynal CD34 祖細(xì)胞分選系統(tǒng) Prod.No. 113.01購自 Dynal Biotech,   Norway公司。造血干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液StemSpan H2000購自Stem Cell Technologies公司; 淋巴細(xì)胞分離液FicollPaqueTM Plus (1 077 g/L)購自Amersham Biosciences公司。IMDM (Iscoves  Modified Dulb

7、eccos Medium)培養(yǎng)基粉末: 購自Gibco公司; 胎牛血清FBS購自Gibco公司。重組人的rhTPO購自于Sigma公司。FITC 標(biāo)記的CD41 mAb、 藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的二抗兔抗鼠IgG（H+L）、 FITC 標(biāo)記的二抗兔抗鼠IgG（H+L）等抗體購自于Southern Biotechnology Associates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。白血病巨核細(xì)胞系Dami、 Meg01購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。其他化學(xué)試劑購自Sigma 公司。    1.2  方法 &#

8、160;  1.2.1  外源基因蛋白的表達(dá)和純化  將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3), 挑取單個(gè)克隆接種于LB/Kan (50 mg/L)培養(yǎng)液中, 37培養(yǎng)過夜。取上述過夜菌液按比例接種于新鮮的LB/Kan培養(yǎng)液, 劇烈振蕩, 37培養(yǎng)23 h至A600為0.50.6, 加異丙基硫代BD半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol/L, 30繼續(xù)繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)3 h 。離心收集菌體沉淀, 超聲波破碎細(xì)胞壁后, 常規(guī)TALON Metal Affinity Resin 親和柱進(jìn)行蛋白純化, 最后用FPLC System色譜儀進(jìn)一步純化表達(dá)產(chǎn)物。

9、電泳鑒定目的蛋白的相對分子質(zhì)量（Mr）和表達(dá)產(chǎn)量。透析過夜, BioRad法測定蛋白質(zhì)濃度后, -80保存?zhèn)溆谩?#160;   1.2.2  雜交瘤細(xì)胞的建立  用0.5 mL純化的hNudC 蛋白(1.7 g/L)與等量福氏完全佐劑混合并完全乳化后,   經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.1 mL/只) 。加強(qiáng)免疫時(shí),   用福氏完全佐劑充分乳化抗原,   注射劑量和部位同前,   共免疫4次,   每次間隔2周。最后1次直接用抗原溶液進(jìn)行免疫。末次

10、免疫后3 d,   取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用間接ELISA法篩選mAb分泌陽性的雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)34次有限稀釋法克隆化后,   選擇2株mAb分泌持續(xù)陽性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),   并按常規(guī)制備腹水。    1.2.3  mAb的效價(jià)測定  采用間接ELISA法。用hNudC (1 mg/L)包被聚苯乙烯板。一抗為適當(dāng)稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水樣本,   二抗為13 000的HRP羊抗鼠IgG,   經(jīng)TMB

11、底物顯色后,   于波長450 nm測定A值。    1.2.4  Ig亞類(型)的鑒定  參照試劑盒中的說明書進(jìn)行。用PBS將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行10倍稀釋,   取150 L滴加到測試管中,   使藍(lán)色膠乳完全重懸。將抗體測定試紙條的黑色一端插入到試管的底部,   待藍(lán)色的陽性控制線條出現(xiàn)時(shí), 取出測試條, 2 min后讀取結(jié)果。    1.2.5  抗血清反應(yīng)特性的Western blot 分析  將hNud

12、C 蛋白進(jìn)行 SDSPAGE分離, 電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC) 膜上, 在封閉液中37緩慢搖動2 h , 用洗滌液洗3次, 與10-3稀釋的 hNudC mAb 在37孵育1 h ,   用洗滌液洗3 次,   每次15 min;  與適當(dāng)稀釋的兔抗鼠 IgGHRP 在37孵育1 h ,   用洗滌液洗3 次,   每次15 min;  BCIP/NBT顯色液中顯色數(shù)分鐘,   待目標(biāo)條帶顯色清晰時(shí),   將NC膜轉(zhuǎn)移到PBS 中停止顯色, 拍照記錄結(jié)果。

13、    1.2.6  人臍血來源的巨核細(xì)胞CD41+培養(yǎng)  每份臍血均取自廣東省造血干細(xì)胞庫。選擇年齡在2435 歲的足月妊娠健康產(chǎn)婦, 無肝炎、 結(jié)核等各種妊娠并發(fā)癥, 樣品經(jīng)正式同意后來自足月分娩的胎兒。在無菌條件下采集樣品, 臍血平均采集量為5080 mL, 4冰箱存放。免疫磁珠分離法體外分離臍血中CD34+細(xì)胞, 無血清液體培養(yǎng)體系中加入50 g/L TPO促進(jìn) CD41+巨核細(xì)胞生長, 37、 50 mL/L CO2條件下共同培養(yǎng), 每34 d半量換液1 次, 培養(yǎng)8 d后收集CD41+細(xì)胞。    1.

14、2.7  白血病巨核細(xì)胞系的培養(yǎng)  白血病巨核細(xì)胞系Dami、 Meg01均用含100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞置于37孵箱中, 在50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。    1.2.8  hNudC蛋白在人巨核細(xì)胞的分布  培養(yǎng)收集人巨核細(xì)胞CD41+細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/L; 取細(xì)胞混懸液, 滴入經(jīng)過L多聚賴氨酸處理后的玻璃載玻片上, 放入濕盒中孵育過夜貼壁, 用40 g/L多聚甲醛固定45 min; 與11 000稀釋后的hNudC mAb孵育1 h; 然后與11 000稀釋后

15、的PE標(biāo)記的二抗兔抗鼠IgG孵育1 h; 用PBS緩沖液5 min×3次, 與11 000稀釋后FITC標(biāo)記的CD41 mAb孵育1 h; PBS緩沖液5 min×3次, 與DNA核染料1 000 g/L DAPI, 4孵育1530 min。PBS緩沖液5 min×3次, 封片, 在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù), Nikon COOL PIX4500數(shù)碼相機(jī)攝影記錄。    1.2.9  hNudC蛋白在白血病巨核細(xì)胞系的分布  Dami、 Meg01細(xì)胞培養(yǎng)、 收集、 固定等方法同1.2.8, 與11 000稀釋后的hN

16、udC mAb孵育1 h; 與11 000稀釋后的FITC標(biāo)記的二抗兔抗鼠IgG孵育1 h; 用PBS緩沖液5 min×3次, 與DNA核染料1 000 g/L DAPI, 4孵育1530 min。PBS緩沖液5 min×3次, 封片, 在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù), Nikon COOL PIX4500數(shù)碼相機(jī)攝影記錄。    1.2.10   hNudC蛋白在人巨核細(xì)胞和白血病巨核系細(xì)胞株中的表達(dá)  收集對數(shù)生長期的人巨核細(xì)胞與Dami、 Meg01細(xì)胞株, 在500 L細(xì)胞裂解液（含Protease Inhibitor Cocktail）中快速勻漿。4抽提1.5 h, 4  12 000 r/min離心15 min,  吸取上清提取人巨核細(xì)胞與Dami、 Meg01細(xì)胞株的總蛋白分裝-80凍存。制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測定所提取的蛋白濃度。使用Western blot 分析hNudC蛋白在人巨核細(xì)胞和白血病巨核系細(xì)胞株中的表達(dá), 每組樣品均重復(fù)2次。