離子交換柱層析分離核苷酸

1、離子交換柱層析分離核苷酸 來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng) 作者：未知 發(fā)布時(shí)間：2006-08-06 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)以酵母RNA為材料，將RNA用堿水解成單核苷酸，再用離子交換柱層析進(jìn)行分離，最后采用紫外吸收法進(jìn)行鑒定。同時(shí)通過(guò)測(cè)定各單核苷酸的含量，可以計(jì)算出酵母RNA的堿基組成。本實(shí)驗(yàn)的目的是：1.了解掌握RNA堿水解的原理和方法2.掌握離子交換柱層析的分離原理和方法3.熟練掌握紫外吸收分析方法二、實(shí)驗(yàn)原理1.RNA的堿水解實(shí)驗(yàn)室制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法（酸、堿水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基；用堿水解可得到2一核苷酸和3一核苷酸的混合物；用5一磷酸二酯酶或3一磷酸二酯酶水解則

2、分別可得到5一核苷酸或3一核苷酸。RNA用堿水解，經(jīng)過(guò)2、3一環(huán)核苷酸中間物，而后水解生成2一核苷酸和3一核苷酸。如下圖所示。堿水解一般采用0.3M的KOH，37保溫1820小時(shí)就能水解完全（也可以用1MKOH，80水解60min或0.1MKOH100水解20min）。水解畢，用2MHClO4中和并逐滴調(diào)節(jié)至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，離心去除之。上清液即為各單核苷酸的混合液。然后根據(jù)所選離子交換劑的類型，將上清液調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H值，作樣品液備用。一般用陽(yáng)離子交換劑，pH調(diào)至1.5左右，用陰離子交換劑，pH調(diào)至89(逐滴)。此處用KOH是為了便于除去鉀離子以降低樣品溶液中的離子強(qiáng)度。2.

3、單核苷酸的離子交換柱層析分離離子交換層析是根據(jù)各種物質(zhì)帶電狀態(tài)（或極性）的差別來(lái)進(jìn)行分離的。電荷不同的物質(zhì)對(duì)離子交換劑有不同的親和力，因此，要成功地分離某種混合物，必須根據(jù)其所含物質(zhì)的解離性質(zhì)，帶電狀態(tài)選擇適當(dāng)類型的離子交換劑，并控制吸附和洗脫條件（主要是洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值）,使混合物中各組分按親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來(lái)。在離子交換層析中，分配系數(shù)或平衡常數(shù)（Kd）是一個(gè)重要的參數(shù)：Kd=Cs/Cm式中：Cs是某物質(zhì)在固定相（交換劑）上的摩爾濃度，Cm是該物質(zhì)在流動(dòng)相中的摩爾濃度?？梢钥闯觯c交換劑的親和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各種物質(zhì)Kd值差異的大小決定了分離的效果。

4、差異越大，分離效果越好。影響Kd值的因素很多，如被分離物帶電荷多少，空間結(jié)構(gòu)因素，離子交換劑的非極性親和力大小，溫度高低等。實(shí)驗(yàn)中必須反復(fù)摸索條件，才能得到最佳分離效果。核苷酸分子中各基團(tuán)的解離常數(shù)（pK）和等電點(diǎn)pI值見(jiàn)表1。表1四種核苷酸的解離常數(shù)（pK）和等電點(diǎn)pI值核苷酸 第一磷酸基pKa1 第二磷酸基pKa2 含氮環(huán)的亞氨基（NH+=）pKa3 等電點(diǎn)pI值*尿苷酸UMP鳥(niǎo)苷酸GMP腺苷酸AMP胞苷酸CMP 1.00.70.90.8 6.46.16.26.3 2.43.74.5 1.552.352.65*注：pI=(pKa1+pKa3)/2由表1可見(jiàn),含氮環(huán)亞氨基的解離常數(shù)（pK）值

5、相差較大，它在離子交換分離四種核苷酸中將起決定作用。用離子交換樹(shù)脂分離核苷酸，可通過(guò)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值使它們的可解離基團(tuán)解離，帶上正電荷或負(fù)電荷。同時(shí)減少樣品溶液中除核苷酸外的其它離子的強(qiáng)度。這樣，當(dāng)樣品液加入到層析柱時(shí)，核苷酸就可以與離子交換樹(shù)脂相結(jié)合。洗脫時(shí)，通過(guò)改變pH值或增加洗脫液中競(jìng)爭(zhēng)性離子的強(qiáng)度，使被吸附的核苷酸的相應(yīng)電荷降低，與樹(shù)脂的親和力降低，結(jié)果使核苷酸得到分離。混合核苷酸可以用陽(yáng)離子或陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離。采用陽(yáng)離子交換時(shí)，控制樣品液pH值在1.5，此時(shí)UMP帶負(fù)電，而AMP、CMP、GMP帶正電，可被陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附。然后通過(guò)逐漸升高pH值，將各核甘酸洗脫下來(lái)，次序是U

6、MP-GMP-CMP-AMP。AMP與CMP洗脫位置的互換，是由于聚苯乙烯樹(shù)脂母體對(duì)嘌呤堿基的非極性吸附力大于對(duì)嘧啶堿基的吸附力造成的。本實(shí)驗(yàn)采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季銨堿型粉末陰離子樹(shù)脂（2018）分離四種核苷酸.首先使RNA堿水解液中的其它離子強(qiáng)度降至0.02以下，然后調(diào)pH值至6以上，使樣品核苷酸都帶上負(fù)電荷，它們都能與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合。結(jié)合能力的強(qiáng)弱，與核苷酸的pI值有關(guān)，pI越大，與陰離子交換樹(shù)脂的結(jié)合力越弱，洗脫時(shí)越易交換下來(lái)。由表1可見(jiàn)，當(dāng)用含競(jìng)爭(zhēng)性離子的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫下來(lái)的次序應(yīng)該是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本實(shí)驗(yàn)所用的樹(shù)脂的不溶性基質(zhì)是非極性的,它與嘌

7、呤堿基的非極性親和力大于與嘧啶堿基的非極性親和力。所以，實(shí)際洗脫下來(lái)的次序?yàn)椋篊MP、AMP、UMP和GMP。對(duì)于同一種核甘酸的不同異構(gòu)體而言，它們之間的差別僅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2磷酸基較3磷酸基距離堿基更近，因而它的負(fù)電性對(duì)堿基正電荷的電中和影響較大,其pK值也較大。例如2-胞苷酸的pK1=4.4，3-胞苷酸的pK1=4.3，因此2一核苷酸更易被洗脫下來(lái)。應(yīng)注意的是，樣品不易過(guò)濃，洗脫的流速不宜過(guò)快，洗脫液的pH值要嚴(yán)格控制。否則將使吸附不完全，洗脫峰平坦而使各核苷酸分離不清。3.核苷酸的鑒定由于核苷酸中都含有嘌呤與嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（C=CC=C），它能夠強(qiáng)烈地

8、吸收250280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通過(guò)測(cè)定各洗脫峰溶液在220300毫微米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收值，作出紫外吸收光譜圖，與下圖所示的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜進(jìn)行比較，并根據(jù)其吸光度比值（250nm/260nm,280nm/260nm,290nm/260nm）以及最大吸收峰與下頁(yè)“表2”所列標(biāo)準(zhǔn)值比較后，即可判斷各組分為何種核苷酸。根據(jù)各組分在其最大吸收波長(zhǎng)（lmax）處總的吸光度（總Amax）以及相應(yīng)的摩爾消光系數(shù)（E260nm）,可以計(jì)算出RNA中四種核苷酸的微摩爾數(shù)和堿基摩爾數(shù)百分組成。四種核苷酸在pH=24時(shí)的紫外吸收光譜曲線（1）（2）溶液的pH值對(duì)核苷酸的紫外吸收光度值影響較大，故測(cè)定時(shí)需要調(diào)至一定的pH值。三、試劑與器材試