食品酶學(xué)-酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能

1、第二章 酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能第一節(jié) 酶分子組成酶酶單純酶單純酶結(jié)合酶結(jié)合酶（全酶）（全酶）= 酶蛋白酶蛋白 + 輔因子輔因子輔因子輔因子輔酶輔酶 與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。輔基輔基 與酶蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。金屬激活劑金屬激活劑 金屬離子作為輔助因子。 蛋白質(zhì)具有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)以及大分子組織形式。 酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。 輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。第二節(jié) 酶的結(jié)構(gòu)與功能酶蛋白的結(jié)構(gòu),包括一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu),與酶的催化功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起酶催化作用的改變或者喪失。研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是酶學(xué)的核心課題。 一、酶的活性中

2、心（一）活性中心（一）活性中心酶蛋白上只有少數(shù)氨基酸殘基參與酶對(duì)底物的結(jié)合和催化，這些相關(guān)氨基酸殘基在空間上比較靠近，形成一個(gè)與酶顯示活性直接有關(guān)的區(qū)域（在酶分子表面上具有三維結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域）,稱為酶的活性中心，又稱活性部位(active site）。構(gòu)成活性中心的化學(xué)基團(tuán)實(shí)際上就是酶蛋白氨基酸殘基的側(cè)鏈，有時(shí)尚包括肽鏈末端的氨基酸。胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ile16、His57、Asp102、Asp194、ser195。在酶原形式時(shí)它們分散在一條肽鏈上,但酶原經(jīng)激活后，形成A、B、C三條肽鏈。前3個(gè)殘基在B鏈,后2個(gè)在C鏈。依靠肽鏈的折疊，包括肽鏈間的二硫鍵，使這些互相遠(yuǎn)離的基團(tuán)靠近。(二)

3、必需基團(tuán)酶活性中心的一些化學(xué)基團(tuán)為酶發(fā)揮催化作用所必需，故稱為必需基團(tuán)。在酶活性中心以外的區(qū)域，也有不和底物直接作用的必需基團(tuán)，稱為活性中心外的必需基團(tuán)。這些基團(tuán)與維持整個(gè)酶分子的空間構(gòu)象有關(guān)，間接地對(duì)酶的催化活性發(fā)揮作用。Koshland將酶分子中的氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團(tuán)分成四類：1. 接觸殘基(contact residues) 如R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164和R165。和底物直接接觸,參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變，是活性中心的主要組成部分。這些殘基中的一個(gè)或幾個(gè)原子與底物分子的一個(gè)或多原子接觸的距離都是一鍵距離(即0.150.2nm)之內(nèi)。2. 輔助殘基(auxiliary r

4、esidues) 如R4，雖未直接與底物接觸，但在使酶與底物相互結(jié)合以及在輔助接觸殘基發(fā)揮作用上起著一定的作用。輔助殘基也是活性中心一個(gè)不可缺少的組成部分。接觸和輔助殘基組成酶的活性中心。接觸殘基的側(cè)鏈中，有的可能擔(dān)負(fù)和底物結(jié)合的作用, 稱為結(jié)合基團(tuán)；有的可能參與使底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的催化作用，稱為催化基團(tuán)。結(jié)合基團(tuán)也可參與催化作用輔助殘基，因不與底物接觸， 只能參與輔助催化基團(tuán)的作用，如質(zhì)子的供給或接受等。3、結(jié)構(gòu)殘基(structural residues) 如R10、R162、R169等，這些殘基在維持酶蛋白形成一種有規(guī)則的空間構(gòu)象方面起著重要作用。對(duì)酶活性的顯示也有一定貢獻(xiàn)，但離底物分子較

5、遠(yuǎn)，不能列人活性中心的范圍，屬于活性中心以外的必需基團(tuán)。4、非貢獻(xiàn)殘基 (non-contributing residues) 在酶的活性中心外, 不參與酶的催化功能，對(duì)酶活性的顯示不起作用。如圖中的R3、R5、R7以及圖中未列入的一些殘基,這些殘基可以被取代， 甚至把它們?nèi)サ粢膊粫?huì)對(duì)酶的構(gòu)象和功能產(chǎn)生重大改變。（三）酶活性中心的特點(diǎn)（三）酶活性中心的特點(diǎn)2. 2. 都是酶分子表面的一個(gè)凹穴，有一定的大小和形都是酶分子表面的一個(gè)凹穴，有一定的大小和形狀，但不是剛性的，而具有一定的柔性。狀，但不是剛性的，而具有一定的柔性。3. 3. 活性中心為非極性的微環(huán)境，有利于與底物結(jié)合。活性中心為非極性的

6、微環(huán)境，有利于與底物結(jié)合。1. 1. 活性中心在酶分子總體積中只占相當(dāng)小的部分活性中心在酶分子總體積中只占相當(dāng)小的部分（約（約1%1% 2%2%），相當(dāng)于），相當(dāng)于2 2 3 3個(gè)氨基酸殘基。個(gè)氨基酸殘基。（三）酶活性中心的特點(diǎn)（三）酶活性中心的特點(diǎn)4. 4. 底物與酶通過形成較弱鍵力的次級(jí)鍵相互作用底物與酶通過形成較弱鍵力的次級(jí)鍵相互作用并結(jié)合到酶的活性中心。并結(jié)合到酶的活性中心。 5. 5. 酶的活性部位并不是和底物的幾何圖形正好吻酶的活性部位并不是和底物的幾何圖形正好吻合，而是在酶與底物結(jié)合的過程中，底物分子或合，而是在酶與底物結(jié)合的過程中，底物分子或酶分子或它們兩者的構(gòu)象同時(shí)發(fā)生一定變

7、化后才酶分子或它們兩者的構(gòu)象同時(shí)發(fā)生一定變化后才相互契合，這時(shí)催化基團(tuán)的位置也正好處于所催相互契合，這時(shí)催化基團(tuán)的位置也正好處于所催化底物的敏感化學(xué)鍵部位?；孜锏拿舾谢瘜W(xué)鍵部位。 二、酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)是酶的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，是催化功能的基礎(chǔ)。一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變將使酶的催化功能發(fā)生相應(yīng)的改變。酶原是活性酶的前體，需經(jīng)激活才顯示出酶的性。由酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦?，可通過酶或氫離子的催化而實(shí)現(xiàn)。胰蛋白酶原在胰蛋白酶或腸激酶的作用下，使酶原變?yōu)榛钚缘拿?。酶原轉(zhuǎn)變成酶時(shí)，一級(jí)結(jié)構(gòu)僅僅發(fā)生微小的變化，在碳鏈的N-末端失去了一個(gè)六肽，從而使隱蔽的活性基團(tuán)解放出來,形成了活性部位。三、酶的二級(jí)和三級(jí)結(jié)

8、構(gòu)與催化功能的關(guān)系二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)是所有酶都必須具有的空間結(jié)構(gòu),是維持酶的活性部位所必須的構(gòu)型。當(dāng)酶蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)徹底改變，就可使酶遭受破壞而喪失其催化功能。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，也可以使酶形成正確的催化部位而發(fā)揮其催化功能。由于底物的誘導(dǎo)而引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，與適應(yīng)的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發(fā)揮其催化功能誘導(dǎo)契合學(xué)說的基礎(chǔ)。1.酶的變性和失活酶受到變性因素的作用，空間結(jié)構(gòu)破壞，其活性中心的構(gòu)象也隨著改變，酶因此失活。有時(shí)只要維持酶活性中心各基團(tuán)的相對(duì)位置，即使一級(jí)結(jié)構(gòu)受到輕微破壞，酶活性也不會(huì)改變。牛胰核糖核酸酶(RNA酶) 有4對(duì)二硫鍵及很多氫鍵維持

9、其空間構(gòu)象; 活性中心中有兩個(gè)組氨酸（His12及His119）。用枯草桿菌蛋白酶處理，被水解成為N端的肽(S肽)和其余的104肽(S蛋白)兩個(gè)片段，分別含有His12和His119，兩者單獨(dú)存在時(shí)均無活力，但在pH7.0的介質(zhì)中，將兩者1:1混合，并使S肽與S蛋白間形成氫鍵及疏水鍵連接，則20與21位之間的肽鍵雖不能恢復(fù)，但活力能恢復(fù)。這是因?yàn)镾肽上的His12又與s蛋白上的His119互相靠近，恢復(fù)了原來活性中心的空間構(gòu)象。 核糖核酸酶在其核糖核酸酶在其C C末端用羧酸酶去掉末端用羧酸酶去掉3 3個(gè)氨基酸時(shí)，對(duì)個(gè)氨基酸時(shí)，對(duì)酶的活性幾乎沒有影響，而若用胃蛋白酶去掉酶的活性幾乎沒有影響，而若

10、用胃蛋白酶去掉C C末端末端的的4 4個(gè)氨基酸時(shí)，則酶活性全部喪失。個(gè)氨基酸時(shí)，則酶活性全部喪失。核糖核酸酶，有活性核糖核酸酶，有活性沒活性沒活性有活性有活性酶蛋白的變性有時(shí)是可逆的。當(dāng)某些化學(xué)變性劑去除后，酶可以恢復(fù)原有的空間構(gòu)象，并恢復(fù)酶活力。牛胰核糖核酸酶經(jīng)尿素及-巰基乙醇處理后發(fā)生變性，當(dāng)透析去除變性劑后，酶可自動(dòng)折疊成具有催化活性的原始形式。2.活性中心的撓性近年來的研究證明：酶蛋白活力的變化和變性時(shí)空間構(gòu)象的改變并不是同步的。用紫外分光差光譜、熒光光譜、圓二色光譜、光散射和內(nèi)埋巰基暴露等手段研究肌酸激酶、核糖核酸酶、乳酸脫氫酶及3一磷酸甘油醛脫氫酶等在鹽酸胍和尿素溶液中變性不同時(shí)間

11、的構(gòu)象變化(即肽鏈去折疊的過程)，同時(shí)測(cè)定酶活力的下降，發(fā)現(xiàn)：酶活力的喪失往往先于上述常規(guī)手段所測(cè)出的酶分子的整體構(gòu)象變化。熱變性實(shí)驗(yàn)同樣證明，酶活性喪失在前，整體構(gòu)象變化在后。進(jìn)一步用探測(cè)活性中心構(gòu)象的方法來研究(如3-磷酸甘油醛脫氫酶活性中心的巰基被羧甲基化后再經(jīng)激發(fā)光照，可在活性中心生成具有熒光的NAD共價(jià)結(jié)合物，可通過熒光改變來探測(cè)活性中心的構(gòu)象變化)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性中心的構(gòu)象的改變先于酶分子整體的構(gòu)象改變，而且與活力喪失幾乎同步。即：酶的活性中心的空間結(jié)構(gòu)相對(duì)酶分子整體而言，處于分子中一個(gè)撓性的局部區(qū)域，是由較弱的化學(xué)鍵維持其空間結(jié)構(gòu)，對(duì)各種變性因素較為敏感。低濃度的變性劑在一定條件

12、有時(shí)反而使酶激活，也可證明活性中心的可塑性。3.酶分子的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domain)是指蛋白質(zhì)肽鏈中一段較獨(dú)立的具有完整、致密立體結(jié)構(gòu)的區(qū)域，一般由40400個(gè)氨基酸殘基組成。大多數(shù)酶都有一個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域，如彈性蛋白酶兩個(gè)十分類似的結(jié)構(gòu)域，而木瓜蛋白酶則有兩個(gè)很不一樣的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)肽鏈的折疊和變構(gòu)調(diào)節(jié)等現(xiàn)象中具有重要作用。不同的結(jié)構(gòu)域常有不同的功能。在大多數(shù)蛋白激酶中，兩個(gè)不同功能的區(qū)結(jié)構(gòu)域一般都存在于一條肽鏈中，形成催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，如cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)，鈣-甘油二酶(佛波酯)一磷脂依賴的蛋白激酶C(PKC)以及具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長(zhǎng)因子受體，其調(diào)節(jié)

13、結(jié)構(gòu)域都位于N側(cè)，催化結(jié)構(gòu)域位于C側(cè)。有一些多功能酶，其不同酶活力來自不同的結(jié)構(gòu)域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨?；幕钚?，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。已發(fā)現(xiàn)與凝血及纖維蛋白溶解有關(guān)的蛋白酶由6種不同的結(jié)構(gòu)域以不同的組合方式裝配而成，包括:一羧基谷氨酸域、表皮生長(zhǎng)因子域、三環(huán)(kringle)結(jié)構(gòu)域、指(finger)結(jié)構(gòu)域和接觸因子(CF)域以及類胰蛋白酶的催化域。不同蛋白酶中的相同結(jié)構(gòu)域則往往有相同或類似的功能?？梢园呀Y(jié)構(gòu)域看成是酶蛋白中的一個(gè)功能單位。對(duì)結(jié)構(gòu)域的研究正方興未艾，將來有可能利用不同的結(jié)構(gòu)域用DNA重組技術(shù)

14、組裝成新的人工酶蛋白。四、酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的酶，按其功能可分為兩類：一類與催化作用有關(guān)，另一類與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切。只與催化作用有關(guān)的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的酶：由數(shù)個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基都有一個(gè)活性中心。四級(jí)結(jié)構(gòu)完整時(shí)，酶的催化功能才會(huì)充分發(fā)揮出來。當(dāng)四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，亞基被分離，若采用的分離方法適當(dāng)，被分離的亞基仍保留著各自的催化功能。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶用溫和的琥珀酸的方法使四級(jí)結(jié)構(gòu)解離時(shí)，分離得到的亞基仍各自保持催化功能；當(dāng)用強(qiáng)烈的條件如酸、堿、表面活性劑等破壞其四級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，得到的亞基沒有催化活性。與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的酶：其組成亞基中，有的亞基具有調(diào)節(jié)中心（激活中心

15、和/或抑制中心），使酶的活性受到激活或者抑制，調(diào)節(jié)酶反應(yīng)的速度和代謝過程。第三節(jié) 酶催化作用的基本理論有過各種酶催化學(xué)說。早期學(xué)說的中心思想是底物的活化，到世紀(jì)60年代，隨著新技術(shù)的發(fā)展，從而亦考慮到在催化反應(yīng)中，酶本身功能基團(tuán)的作用。酶在進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，首先和底物形成ES絡(luò)合物，這樣分子間的催化反應(yīng)就變?yōu)榉肿觾?nèi)的催化反應(yīng)。一、酶底物復(fù)合物酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物（或稱中間絡(luò)合物）。復(fù)合物的形成是專一性決定的過程，也是變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)的過程，同時(shí)又是誘導(dǎo)契合過程。由于中間復(fù)合物的形成，酶和底物的結(jié)構(gòu)都將發(fā)生有利于催化反應(yīng)進(jìn)行的變化。（一）酶一底物復(fù)合物存在的證據(jù)光譜技術(shù)是證明ES復(fù)合

16、物存在的有效手段。醇脫氫酶（ADH）的底物NADH在游離狀態(tài)下，于340nm處有一吸收峰，但加入ADH后,吸收峰移向328nm，再加入巰基試劑對(duì)氯汞苯甲酸又使吸收峰回到340nm，證明NADH和ADH的結(jié)合是通過ADH的巰基介導(dǎo)的。催化絲氨酸和吲哚合成色氨酸的色氨酸合成酶含有磷酸吡哆醛輔基，后者能在激發(fā)下發(fā)出熒光。當(dāng)單加入絲氨酸而尚無吲哚時(shí), 其熒光強(qiáng)度顯著增加，再加入吲哚，就使熒光淬滅，低于單獨(dú)酶的熒光，這就證明酶-絲氨酸復(fù)合物和酶-絲氨酸-吲哚復(fù)合物的存在。大分子底物和酶的復(fù)合物可用電子顯微鏡直接觀察DNA聚合酶與DNA的復(fù)合物。即使小分子底物也可用X射線衍射法獲得酶-底物復(fù)合物的信息，如

17、羧肽酶A是通過哪些殘基和底物甘氨酰-L-酪氨酸結(jié)合的以及溶菌酶的最小六糖底物是怎樣“躺”在酶分子表面的狹長(zhǎng)凹穴中，目前都已研究清楚。有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結(jié)晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結(jié)晶，這也是酶一底物復(fù)合物的直接證據(jù)?，F(xiàn)已充分證明:底物是通過酶的活性中心和酶結(jié)合的。(二)酶與底物形成復(fù)合物的作用力酶與底物的結(jié)合與穩(wěn)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)的力是相同的。1.離子鍵底物分子上的電荷和酶分子上相反電荷之間的作用, 離子鍵受溶劑、鹽濃度、酶活性部位的微環(huán)境以及酶活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)等因素的影響。2.氫鍵底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。酶分子可以在主鏈

18、與側(cè)鏈之間以及某些側(cè)鏈之間形成氫鍵。氫鍵在水中仍然可以保持，但強(qiáng)度減弱。在酸、堿液中氫鍵不存在。在高溫或各種變性劑的作用下，氫鍵會(huì)被破壞。3.范德華力一種非專一性的相互作用力，比離子鍵和氫鍵都弱。酶與底物之間的有效范德華引力作用,，只有在它們相互之間處于立體互補(bǔ)的情況下才能發(fā)生作用。在酶和底物的結(jié)合過程中，許多原子基團(tuán)間的范德華引力的總和將會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的作用。二、酶的催化作用本質(zhì)酶和一般催化劑的共性用量少而催化效率高；它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。酶本身在反應(yīng)前后也不發(fā)生變化。酶能夠穩(wěn)定底物形成的過渡狀態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)的進(jìn)行。過渡態(tài)過渡態(tài)三、酶作用的專一

19、性機(jī)制（一）（一）酶作用的專一性（底物特異性）酶作用的專一性（底物特異性）（Substrate-specificity）（1）低特異性低特異性（Low specificity）:不能辨別底物，僅能對(duì)不能辨別底物，僅能對(duì)裂開的鍵表現(xiàn)特異性，如非特異性脂酶。裂開的鍵表現(xiàn)特異性，如非特異性脂酶。 （2 2）基團(tuán)特異性）基團(tuán)特異性（Group specificity）: : 對(duì)于相鄰于特定對(duì)于相鄰于特定基團(tuán)的一個(gè)特殊的化學(xué)鍵表現(xiàn)出特異性?；鶊F(tuán)的一個(gè)特殊的化學(xué)鍵表現(xiàn)出特異性。 胰蛋白酶對(duì)羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)胰蛋白酶對(duì)羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)特異性。特異性。 O O X-NH-CH

20、-C-NH-CH-COOH ( X-NH-CH-C-NH-CH-COOH (精氨酸或賴氨酸精氨酸或賴氨酸) ) | | | | R R1 1 R R2 2。 （3 3）絕對(duì)特異性）絕對(duì)特異性（Absolute specificity） 酶僅作用于一種底物并催化一個(gè)反應(yīng)。例如，脲酶只酶僅作用于一種底物并催化一個(gè)反應(yīng)。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。（4 4）立體化學(xué)特異性）立體化學(xué)特異性（Stereochemical specificity） 通常顯示出正確無誤和完全的立體定向性，能區(qū)別光通常顯示出正確無誤和完全的立體定向性，能區(qū)別光學(xué)或立體異

21、構(gòu)體。幾乎總是選擇一對(duì)對(duì)映體中的一種形式學(xué)或立體異構(gòu)體。幾乎總是選擇一對(duì)對(duì)映體中的一種形式做底物，除非酶的特異功能是催化對(duì)映體的異構(gòu)化。做底物，除非酶的特異功能是催化對(duì)映體的異構(gòu)化。（二）酶作用的專一性機(jī)制有多種學(xué)說，得到廣泛支持的有：有多種學(xué)說，得到廣泛支持的有：鎖鑰學(xué)說鎖鑰學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說過渡態(tài)學(xué)說過渡態(tài)學(xué)說共同點(diǎn)：共同點(diǎn)：酶的作用專一性必須通過它的活性中心酶的作用專一性必須通過它的活性中心和底物結(jié)合后才表現(xiàn)出來。和底物結(jié)合后才表現(xiàn)出來。1.鎖鑰學(xué)說1894年，德國(guó)有機(jī)化學(xué)家E.Fisher提出。酶與底物結(jié)合時(shí)，酶活性中心的結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)必須吻合， 就如同鎖和鑰匙一般，非常配

22、合地結(jié)合形成中間復(fù)合物)。當(dāng)中間復(fù)合物形成時(shí)，會(huì)促進(jìn)底物結(jié)構(gòu)發(fā)生某些化學(xué)變化(如底物分子的鍵被扭曲)，變形而斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物?？山忉屆傅牧Ⅲw化學(xué)專一性和底物飽和曲線動(dòng)力學(xué)。 在酶的表面存在著一個(gè)特殊形狀的活性部位，這個(gè)活性部位在結(jié)在酶的表面存在著一個(gè)特殊形狀的活性部位，這個(gè)活性部位在結(jié)構(gòu)上能與底物精確地互補(bǔ)。底物與酶之間存在某種立體專一結(jié)合。底構(gòu)上能與底物精確地互補(bǔ)。底物與酶之間存在某種立體專一結(jié)合。底物類似鑰匙，酶類似鎖。物類似鑰匙，酶類似鎖。獲得相當(dāng)多的事實(shí)支持。乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解。要求底物中的膽堿氮帶正電，為此可推測(cè)：酶分子中至少有一個(gè)陰離子部位與酯解部位。事實(shí)是，這兩部位間有

23、嚴(yán)格的距離，膽堿和酰基間多或少一個(gè)-CH2-都不適于作底物或競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，而符合這種鍵長(zhǎng)、鍵角要求的化合物都能與該酶發(fā)生作用（被酶催化水解或者抑制酶）。缺點(diǎn)：認(rèn)為酶的結(jié)構(gòu)是剛性的， 難以解釋一個(gè)酶可以催化正、逆兩個(gè)反應(yīng)，因產(chǎn)物(或逆反應(yīng)的底物)的形狀、構(gòu)象和底物完全不同。2.誘導(dǎo)契合學(xué)說1958年，Koshand提出酶分子(包括輔酶在內(nèi))的構(gòu)象與底物原來并非恰當(dāng)吻合，只有底物分子與酶分子相碰時(shí)，才可誘導(dǎo)后者的構(gòu)象變得能與底物配合， 然后才結(jié)合形成中間復(fù)合物，進(jìn)而引起底物分子發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化。誘導(dǎo)楔合模型要點(diǎn)：誘導(dǎo)楔合模型要點(diǎn)：（a a）當(dāng)?shù)孜锱c酶的活性部當(dāng)?shù)孜锱c酶的活性部位結(jié)合時(shí)，酶蛋白的幾何

24、位結(jié)合時(shí)，酶蛋白的幾何形狀有相當(dāng)大的改變；形狀有相當(dāng)大的改變；（b b）催化基團(tuán)催化基團(tuán)的的精確定向精確定向?qū)τ诘孜镛D(zhuǎn)變成產(chǎn)物是必對(duì)于底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物是必需的；需的；（c c）底物誘導(dǎo)酶蛋白幾何底物誘導(dǎo)酶蛋白幾何形狀的改變形狀的改變使得催化基團(tuán)使得催化基團(tuán)能精確地走向和底物結(jié)合能精確地走向和底物結(jié)合到酶的活性部位上去。到酶的活性部位上去。A、B催化基團(tuán)催化基團(tuán)C結(jié)合基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)在用X光衍射法研究溶菌酶、彈性蛋白酶等與底物結(jié)合后結(jié)構(gòu)的改變中得到了證實(shí)。能解釋鎖鑰學(xué)說不能解釋的實(shí)驗(yàn)事實(shí)，但也有局限性：不是酶的底物或酶的抑制物，不能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，或即使有少許變化，也不能使酶分子與有關(guān)催化基

25、團(tuán)處于互補(bǔ)契合位置。實(shí)際上，大于底物或小于底物的類似物亦能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化。3.過渡態(tài)學(xué)說(transition state theory)Linus Pauling （20世紀(jì)40年代）提出的過渡態(tài)理論認(rèn)為：酶與底物的過渡態(tài)互補(bǔ)，親和力最強(qiáng)，釋放出結(jié)合能使ES的過渡態(tài)能級(jí)降低，有利于底物分子跨越能壘，使酶促反應(yīng)大大加速?！斑^渡態(tài)”是反應(yīng)物分子處于被激活的狀態(tài)，是反應(yīng)途徑中分子具有最高能量的形式。不同于反應(yīng)中間物。它只不過是一個(gè)短暫的分子瞬間。在這一瞬間分子的某些化學(xué)鍵正在斷裂和形成并達(dá)到能崩解生成產(chǎn)物或再返回生成反應(yīng)物的程度。過渡態(tài)學(xué)說認(rèn)為，酶的作用專一性既寓于酶與底物的結(jié)合，也寓于

26、酶對(duì)底物的催化，酶與底物的結(jié)合不僅促成了結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)的正確取位，同時(shí)也為下一步酶對(duì)底物的催化做了準(zhǔn)備。.表示正在形成和斷裂的化學(xué)鍵表示正在形成和斷裂的化學(xué)鍵乙酸乙酯的水解反應(yīng)乙酸乙酯的水解反應(yīng):過渡態(tài)看來過渡態(tài)看來:過渡態(tài)是一種變動(dòng)的分子。過渡態(tài)是一種變動(dòng)的分子。20世紀(jì)70年代以來，對(duì)很多酶促反應(yīng)的過渡態(tài)類似物(人工設(shè)計(jì)出的類似過渡態(tài)的穩(wěn)定分子)的研究發(fā)現(xiàn)，這些過渡態(tài)類似物與酶的結(jié)合比底物與酶的結(jié)合緊密102106倍，證明了酶與反應(yīng)過渡態(tài)互補(bǔ)的概念是正確的。過渡態(tài)學(xué)說涵蓋了對(duì)專一性機(jī)制和對(duì)高效性機(jī)制的解說。第四節(jié) 酶在生物體內(nèi)存在的幾種形式一、單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物單體酶、寡聚酶和

27、多酶復(fù)合物酶和其他蛋白質(zhì)一樣，由種L-氨基酸組成,也有特定的氨基酸排列和特定的空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)酶蛋白分子結(jié)構(gòu)可將酶分為三類。單體酶單體酶寡聚酶寡聚酶多酶復(fù)合物多酶復(fù)合物（一）單體酶(monomeric enzyme) 僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應(yīng)。（二）寡聚酶（二）寡聚酶（oligomeric enzyme）寡聚酶具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，至少有2個(gè)亞基,多的可達(dá)60個(gè)以上，相對(duì)分子質(zhì)量在3.5萬至百萬以上。組成寡聚酶的亞基可以相同，也可以不同。亞基之間以非共價(jià)鍵結(jié)合。有的亞基上有結(jié)合基團(tuán)，叫結(jié)合亞基，有的亞基上有催化基團(tuán)，叫催化亞基。亞基分離時(shí)沒有活性。（三）多酶復(fù)合體（三）多酶復(fù)合體(

28、multienzyme complex) 多酶復(fù)合體是指幾個(gè)酶嵌合而成的絡(luò)合物，又稱多酶絡(luò)合物。一般由26個(gè)功能相關(guān)的酶組成，有利于生化反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行，以提高酶的催化效率，同時(shí)也便于機(jī)體對(duì)酶的調(diào)控。丙酮酸脫氫酶系（丙酮酸脫氫酶系（E.coliE.coli）：丙酮酸脫氫酶（）：丙酮酸脫氫酶（E E）、）、硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（E E）和二氫硫辛酰脫氫酶（）和二氫硫辛酰脫氫酶（E E）。）。EEE堿性EEE+EE+脲二、同工酶（isozyme）同工酶是指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，各同工酶的理化性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)都存在很多差異。同工酶不僅存在

29、于同一機(jī)體的不同組織中，也存在于同一組織細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的同工酶達(dá)數(shù)百種，其中研究得最多的是乳酸脫氫酶(LDH)。哺乳動(dòng)物中有5種乳酸脫氫酶同工酶. NAD+ NADH + H+CH3-CHOH-COOH CH3-CO- COOH乳酸 丙酮酸 用電泳法分離LDH可得到5種同工酶區(qū)帶。都是由H和M二種不同類型的亞基組成的四聚體。乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜 是研究代謝調(diào)節(jié)、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、分子遺傳是研究代謝調(diào)節(jié)、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、分子遺傳等方面的有力工具。等方面的有力工具。 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的好材料。研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的好材料。 在臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)

30、遺傳育種、病理分析上都有應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)遺傳育種、病理分析上都有應(yīng)用價(jià)值價(jià)值 。同工酶的測(cè)定可作為某些疾病的診斷指標(biāo)。正常人血清LDH主要來自紅細(xì)胞滲出，活力很低。當(dāng)某一組織病變時(shí)，血清LDH同工酶電泳圖譜會(huì)發(fā)生變化。如肝細(xì)胞受損早期，LDH總活性在正常范圍內(nèi)，但LDH5升高；急性心肌病變時(shí)，LDHl可升高。蜂蜜品質(zhì)同工酶電泳檢測(cè)比較兩種天然蜂蜜與摻假所用的工業(yè)淀粉酶的同工酶電泳，發(fā)現(xiàn)天然蜂蜜的淀粉酶同工酶酶譜和工業(yè)淀粉酶的同工酶酶譜存在差異。 三、別構(gòu)酶與修飾酶別構(gòu)酶(變構(gòu)酶)與修飾酶統(tǒng)稱為調(diào)節(jié)酶。調(diào)節(jié)酶通常在一連串的反應(yīng)中催化單向反應(yīng)，或催化反應(yīng)速度最慢的反應(yīng)步驟。其活性的改變可以決定

31、全部反應(yīng)的總速度，甚至可以改變代謝的方向，故又稱為限速酶(或關(guān)鍵酶)。（一）別構(gòu)酶（allosteric enzyme）一類較復(fù)雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構(gòu)中心?；钚灾行呢?fù)責(zé)對(duì)底物結(jié)合和催化，別構(gòu)中心則與調(diào)節(jié)催化速度有關(guān)。當(dāng)某些代謝物以非共價(jià)方法結(jié)合于別構(gòu)中心部位后，可使酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶活性，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng)?？砂l(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶稱為別構(gòu)酶，可引發(fā)別構(gòu)效應(yīng)的代謝物稱為別構(gòu)效應(yīng)劑。別構(gòu)酶通常由多個(gè)亞基組成，活性中心和別構(gòu)中心可分布在不同的亞基，也可分布在同一亞基的不同部位，能結(jié)合別構(gòu)效應(yīng)劑的亞基為別構(gòu)亞基。別構(gòu)效應(yīng)劑一般為小分子代謝物，可以是別構(gòu)酶的底物，也可以是代

32、謝通路上的產(chǎn)物。根據(jù)別構(gòu)效應(yīng)劑與酶結(jié)合后的效果，可將其分為兩類，使酶活性升高者稱為別構(gòu)激活劑，使酶活性降低者稱為別構(gòu)抑制劑。異檸檬酸脫氫酶是別構(gòu)酶，NAD+、ADP和檸檬酸是該酶的別構(gòu)激活劑，而NADH和ATP是別構(gòu)抑制劑。變構(gòu)酶的特點(diǎn)：變構(gòu)酶的特點(diǎn)：變構(gòu)酶分子上除了活性中心外，還有調(diào)節(jié)中變構(gòu)酶分子上除了活性中心外，還有調(diào)節(jié)中心。這兩個(gè)中心處在酶蛋白的不同部位，有心。這兩個(gè)中心處在酶蛋白的不同部位，有的在不同的亞基上，有的在同一亞基上。的在不同的亞基上，有的在同一亞基上。變構(gòu)酶的變構(gòu)酶的 v-S v-S 的關(guān)系不符合米氏方程，所的關(guān)系不符合米氏方程，所以其曲線不是雙曲線型。以其曲線不是雙曲線型

33、。已知的變構(gòu)酶都是寡聚酶。已知的變構(gòu)酶都是寡聚酶。（二）修飾酶(modification enzyme)1、修飾酶的類型某些酶能在其他酶的催化下，通過共價(jià)鍵可逆結(jié)合某種化學(xué)基團(tuán)，從而改變其活性，這種作用稱為共價(jià)修飾調(diào)節(jié)，這類酶稱為共價(jià)修飾酶或化學(xué)修飾酶。修飾酶活性的改變是通過共價(jià)鍵結(jié)合，別構(gòu)酶活性的改變是通過非共價(jià)鍵結(jié)合。修飾酶的共價(jià)修飾有磷酸化/脫磷酸化、乙酰化/去乙?；⑾佘栈?去腺苷化、甲基化/去甲基化、-SH/- S-S-等，其中磷酸化/脫磷酸化最為常見。2、修飾酶的特點(diǎn)（1）絕大多數(shù)修飾酶具有無活性/有活性(或低活性/高活性)兩種形式，催化其正逆兩方向反應(yīng)的酶不同，且受激素或第二信使

34、的調(diào)節(jié)。（2）耗能少 磷酸化/脫磷酸化是最常見的共價(jià)修飾。每個(gè)亞基磷酸化僅僅需1分子ATP，比生物合成多肽鏈消耗的ATP少得多，速度也快得多。（3）效率高 由于化學(xué)修飾反應(yīng)一般是酶促反應(yīng)，且受體內(nèi)調(diào)節(jié)因子控制，故對(duì)調(diào)節(jié)信號(hào)有快速、放大的效應(yīng)。體內(nèi)酶促化學(xué)修飾反應(yīng)往往是連鎖反應(yīng)，即一種酶經(jīng)化學(xué)修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子進(jìn)行化學(xué)修飾，每修飾一次就產(chǎn)生一次放大效應(yīng)。因此，極少量的調(diào)節(jié)因子經(jīng)化學(xué)修飾酶的逐級(jí)放大，可產(chǎn)生顯著的生理效應(yīng)。環(huán)磷腺苷 四、結(jié)構(gòu)酶(組成酶)與誘導(dǎo)酶根據(jù)合成與代謝的關(guān)系，將酶相對(duì)地分為結(jié)構(gòu)酶和誘導(dǎo)酶。結(jié)構(gòu)酶(structural enzym)是細(xì)胞以恒定速率和恒定數(shù)量

35、生成的那些酶類，亦稱組成酶。細(xì)胞中天然存在, 含量較穩(wěn)定， 一般不受外界條件的影響。誘導(dǎo)酶(induced enzyme)是指細(xì)胞中進(jìn)入特定的誘導(dǎo)物后, 被誘導(dǎo)生成的。其有無及含量的多少受外界條件的影響。在某些種類的細(xì)菌細(xì)胞中，正常時(shí)只存在痕跡量的誘導(dǎo)酶，但當(dāng)培養(yǎng)基中有特定的誘導(dǎo)物(往往是該酶的底物或底物類似物)時(shí)，酶的數(shù)量能迅速增加1000多倍，尤其當(dāng)這種底物是細(xì)胞唯一的碳源時(shí)。光度密小 時(shí) （ h）143929.526.543.513.5(a)(b)(c) 010203040506070E.coli二度生長(zhǎng)現(xiàn)象二度生長(zhǎng)現(xiàn)象a：葡萄糖：葡萄糖50 g/mL，山梨糖醇，山梨糖醇150 g/mL

36、；b：葡萄：葡萄糖糖100 g/mL，山梨糖醇，山梨糖醇100g/mL；C：葡萄糖：葡萄糖150g/mL；山梨糖醇；山梨糖醇50 g/mL）五、胞內(nèi)酶與胞外酶按酶合成后分布和存在的位置, 可將酶分為胞內(nèi)酶與胞外酶。胞內(nèi)酶(intracellular enzyme）是指那些在合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)的酶;胞外酶(extracellular enzyme)是指那些在合成后分泌到細(xì)胞外而游離在發(fā)酵液中的酶。在中文文獻(xiàn)中常將“ectoenzyme” 譯為胞外酶, 但它和通常所說的胞外酶(extracellular enzyme)不同, 它是一種和細(xì)胞膜結(jié)合的酶, 其活性中心位于細(xì)胞的外表面, 指向細(xì)胞外空間, 作用還未完全清楚。第五節(jié) 酶活力測(cè)定1. 1.