層析技術(shù)在生物醫(yī)藥及食品中的應(yīng)用

1、層析技術(shù)在生物醫(yī)藥及食品中的應(yīng)用摘 要層析分離技術(shù)作為一種天然產(chǎn)物精制技術(shù)，其不但分離能力、選擇性、通用性均高，且在食品及生物領(lǐng)域顯示出極大的應(yīng)用潛力。本文綜述親和層析技術(shù)在食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進展情況。關(guān)鍵詞：層析技術(shù) 食品 生物醫(yī)藥 應(yīng)用 AbstractChromatography separation technology as a kind of natural products, refined technology, not only the separation ability, high selectivity, generality, and in the field

2、of food and biological shows great potential applications.In this paper, affinity chromatography technology in food and application progress in the field of biomedicine.Keywords:Tomographic techniques food biomedical applications1 引言層析本身是由植物天然產(chǎn)物分離純化發(fā)展出來的，其起源是在1903年由俄國的植物學(xué)家Tswett首先以碳酸鈣作為固定相，在玻璃柱上將葉綠素

3、、葉黃素和胡蘿卜素進行了分離1。 它是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用的能力不同，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的2。按其原理可分為分為：高效液相層析、 離子交換層析、 凝膠層析、 親和層析。層析分離技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的一種天然產(chǎn)物精制技術(shù)，它具備了較高的分離能力、選擇性、通用性而成本相對較低，操作條件溫和3，因而顯示出巨大的潛力，在食品及生物領(lǐng)域中一些活性物質(zhì)的分離純化方面起著至關(guān)重要的作用，尤其是蛋白質(zhì)的分離純化，也正因此而備受關(guān)注。本文將著重綜述親和層析技術(shù)在食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進展情況。2 親和層析

4、技術(shù)在生物及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進展親和層析是 60 年代發(fā)展起來的一種高效 、快速蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。其原理是利用蛋白質(zhì)分子與某一分子專一可逆結(jié)合的生物特性 ,來選擇分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。親和層析容量大 ,分離效率高 ,且對目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性起到一定的保護作用。層析技術(shù)在生物制藥中主要應(yīng)用于藥物的鑒定和純度檢查;藥物中微量雜質(zhì)的分離和鑒定;藥物的降解率和降解產(chǎn)物的測定;制劑中藥物的鑒定及其含量測定;制劑中降解產(chǎn)物的測定, 分離供毒性試驗的物質(zhì);對小劑量處方中藥物, 檢測含量的均勻性; 測定體液中藥物和代謝物的濃度, 以便確定藥物在體內(nèi)的吸收, 生物利用度和消除；分析藥物及雜質(zhì)); 藥物生產(chǎn)原料的鑒定和純

5、度測定。層析技術(shù)在需要捕獲小型質(zhì)粒DNA 或病毒的大規(guī)模生產(chǎn)中特別有優(yōu)勢。在基因治療載體的純化方面，膜層析日益被認為是一項可行性技術(shù)。膜層析可有效地去除模型病毒，比如豬細小病毒、 甲型肝炎病毒、 鼠白血病病毒和偽狂犬病病毒。 隨著染料配基 、人工定向合成配基的應(yīng)用和配基偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展 ,親和層析技術(shù)更加適用化4。由于任何蛋白質(zhì)都具有抗原性 , 通過雜交瘤技術(shù)均可制備相應(yīng)的特異性單抗 , 以單抗為親和配基 ,去分離對應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì) ,可以實現(xiàn)各種天然 、重組蛋白質(zhì)的高效 、快速分離純化 。近年來 ,隨著人們對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的深入研究和其它學(xué)科的發(fā)展 ,又出現(xiàn)了一些新的蛋白質(zhì)層析方法 , 如金屬螯

6、合層析 、層析聚焦等5,6?，F(xiàn)將從生物特性親和及人工配基親和兩大方面進行概述。生物特異親和層析法包括免疫親和層析、凝集素親和層析、核酸親和層析等，另外還有以酶或底物為配基的親和層析或以粘附蛋白或受體蛋白為配基的親和層析，其特點是配基為生物分子。免疫親和層析是利用抗體與其相應(yīng)抗原的作用具有高度的特異性和高度結(jié)合力的特點，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到層析載體上，便可有效的分離和純化各自互補的免疫物質(zhì)。Li等用吸附層析結(jié)合免疫親和層析的方法分離純化得到一種蛋白復(fù)合體，該復(fù)合體含有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的輔阻遏物蛋白SMRT和N一coR7。單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動了免疫親和層析技術(shù)的發(fā)展。只要得到特定單抗，

7、利用其作為配基，通過親和層析，即可從復(fù)雜的混合物中分離、純化特定抗原成份1992年，Lorcnzen將抗病毒性出血敗血病病毒 (VHSV)的單抗作為親和配基，經(jīng)免疫親和層析法純化該病毒的四種結(jié)構(gòu)蛋白8。凝集素親和層析適合對一些寡糖或糖膚進行結(jié)構(gòu)分析，其具有特異、敏感、快速的特點。凝集素是一類糖結(jié)合蛋白，最先是由植物中分離到的，它可與蛋白的寡糖部分特異結(jié)合。因為不同的凝集素能夠特異地結(jié)合某種寡糖或者糖膚，使得凝集素成為糖鏈結(jié)構(gòu)分析的一種常用工具9-11。目前常用于親和層析的凝集素主要有麥胚凝集素(wGA)和伴刀豆凝集素A(ConA)。麥胚凝集素特異結(jié)合B一N一乙酞葡萄糖胺和唾液酸，伴刀豆凝集素A

8、特異結(jié)合a一甘露糖、a一葡萄糖和a一N一乙酞葡萄糖胺。另一種較為常用的是對乙酸氨基葡萄糖專一的曼陀羅凝集素，可用于多巴胺D一受體的提純12。沈國光等應(yīng)用植物凝集素親和層析結(jié)合離子交換和銀環(huán)蛇毒素親和層析分離純化了作銀環(huán)蛇神經(jīng)毒素結(jié)合蛋白，為進一步分析、鑒定大鼠隔肌的你銀環(huán)蛇毒素結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)13。核酸親和層析被認為是目前分離多聚核普酸及其結(jié)合蛋白的最有力方法，含有特異寡核普酸的親和樹脂能用于某些酶的分離，Locke等把雙鏈DNA接到纖維素上，有效地純化了鏈霉菌脫氧核糖核酸酶14。除了上述生物特性親和層析外，人工配基親和層析也有著較廣泛的應(yīng)用。人工配基親和層析也稱為通用配基親和層

9、析，是指利用一些人工配基對不同的蛋白質(zhì)有親和性的特點，通過親和層析來純化這些蛋白質(zhì)的方法。主要包括金屬鰲合親和層析和染料配基親和層析等。 金屬鰲合親和層析(MCAC)是近30年來出現(xiàn)的一種親和層析技術(shù)，也稱固相化金屬離子親和層析。金屬鰲合親和層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點。由于該方法幾乎對蛋白質(zhì)本身的生物活性沒有依賴，所以，除了可以在常規(guī)的非變性條件下進行純化外還特別適合分離純化變性蛋白，尤其是帶6個組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白廣泛應(yīng)用于大腸桿菌表達包涵體蛋白質(zhì)的分離及純化15，是分離純化生物工程蛋白質(zhì)產(chǎn)品最有效的工具之一。Ueda等應(yīng)用Ni離子親和層析，之后結(jié)合分子篩層析，

10、分離純化了大腸桿菌表達的人催乳素。分別經(jīng)聚丙烯酞胺凝膠電泳、等電聚焦電泳以及質(zhì)譜洲ALDI一TOF一MS)和高效分子篩層析鑒定分析，純度達到99%。經(jīng)NbZ細胞增殖活性分析，該重組蛋白的生物活性達 40.9Iu/mg16。染料親和層析是1968年Haeekel和oppersehlager分別偶然發(fā)現(xiàn)的。他們發(fā)現(xiàn)藍染料和磷酸化激酶有專一性作用，并成功地應(yīng)用于純化酵母中磷酸激酶。染料配體親和層析具有蛋白結(jié)合容量大，是天然配基蛋白質(zhì)結(jié)合量的10一100倍，配基偶聯(lián)方法簡單，易于操作，蛋白質(zhì)洗脫容易，適于大規(guī)模應(yīng)用17。3 親和層析技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用 食品安全問題是一個全球話題， 近年來， 國際上食

11、品安全惡性 事 件 頻 頻 出現(xiàn)， 造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前,食品安全主要出現(xiàn)在包括農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、有機污染物、添加劑、生物毒素、人畜疾病病原體等方面。因此開發(fā)出能夠滿足要求的快速、方便、準確、靈敏的食品安全分析檢測技術(shù)是當(dāng)前迫切需要進行的18。免疫層析技術(shù)（Immunochromtogaphic Assay, ICA）19是上世紀八十年代初發(fā)展起來的一種新型免疫檢測技術(shù)，結(jié)合了免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)的優(yōu)勢，具有快速、簡單、低廉、操作時間短、可用于現(xiàn)場篩查等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用于臨床診斷，環(huán)境污染，食品安全檢測以及其他新興領(lǐng)域。根據(jù)免疫標(biāo)記物的不同可將免疫層析技術(shù)分為膠體金免疫層析技術(shù)、

12、熒光微球免疫層析技術(shù)、熒光乳膠免疫層析技術(shù)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)、量子點免疫層析技術(shù)、基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)及磁珠免疫層析技術(shù)等。膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù)是一種發(fā)展較為成熟的標(biāo)記技術(shù)。但是, 降低檢測過程中出現(xiàn)假陽性或假陰性、提高檢測的靈敏度及可重復(fù)性依然是亟待解決的問題30。量子點以其優(yōu)越的熒光強度和穩(wěn)定性成為一種理想的標(biāo)記免疫層析探針, 故開發(fā)具有高通量、選擇性好、檢測簡便的量子點標(biāo)記免疫層析技術(shù)是當(dāng)前研究者的重要任務(wù)。上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料的低毒、穩(wěn)定、成本低等特點成為最有潛力的標(biāo)記免疫層析技術(shù)之一, 但是該技術(shù)在食品中農(nóng)藥、獸藥、違禁物品等殘留方面研究較少。其基本原理是基于檢測樣品溶液借

13、助毛細管作用，在條狀固相纖維層析材料上遷移，由于樣品中的待測物與層析材料上一定區(qū)域內(nèi)的受體（抗體或抗原等）發(fā)生了高特異性的免疫反應(yīng)，形成的免疫復(fù)合物被截留和富集在這一區(qū)域。通過顯色反應(yīng)，肉眼或儀器短時間內(nèi)可判讀結(jié)果。真菌毒素廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品等食品中，亦對人體健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的影響。目前膠體金免疫層析試紙條在真菌毒素檢測方面也得到了快速發(fā)展。包括對黃曲霉毒素20、玉米烯酮21、赭曲霉毒素22和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇23等真菌毒素的檢測。此外該技術(shù)也應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。病原微生物引起的食源性食物中毒是影響我國食品安全問題的主要因素之一，對食源性致病菌的快速檢測在食品安全領(lǐng)域具有積極重要作用

14、。Jung 24等利用雙抗夾心法建立了膠體金免疫層析試紙條檢測大腸桿菌 O157 的方法。其他食源性致病菌，如沙門氏菌25、金黃色葡萄球菌26、單增李斯特菌27、志賀氏菌28和副溶血性弧菌29等也通過免疫層析試紙條建立了相關(guān)的檢測方法。4 總結(jié)綜上所述，層析技術(shù)在生物、醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是免疫層析技術(shù)在食品安全的快速檢測所起的作用日趨重要。不過目前國內(nèi)關(guān)于免疫層析技術(shù)方面的研究遠落后于國外，更深入的研究還有很大的探索空間。故今后標(biāo)記免疫層析技術(shù)的研究可從以下幾個方面深入探索: 1)研究開發(fā)穩(wěn)定劑以提高標(biāo)記物-抗體探針抗干擾能力, 減少假陽性或假陰性現(xiàn)象的發(fā)生; 2)探尋能與標(biāo)

15、記探針相容的生物信號放大物質(zhì), 提高檢測的靈敏度; 3)制備特異性好的類生物抗體或改進標(biāo)記技術(shù)以提高標(biāo)記免疫層析方法的檢測通量, 降低檢測成本; 4)研究標(biāo)記物的制備方法、探索標(biāo)記抗體探針與目標(biāo)物的識別機理, 為拓寬標(biāo)記免疫層析技術(shù)的檢測范圍奠定基礎(chǔ); 5)研究其他標(biāo)記免疫層析技術(shù)以補充食品安全檢測方法。5 參考文獻1Saleh M l，Pok F W. SeParation of Primary and secondary amines as their sulfonamide derivatives by reversed-phase high-Performance liquid chr

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