DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用與技術(shù)比較

1、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用與技術(shù)比擬DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)研究的重要范疇,已經(jīng)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注.近些年來(lái),隨著DNA甲基化與組蛋白甲基化的聯(lián)合作用機(jī)制、RNAT擾機(jī)制及去甲基化機(jī)制的發(fā)現(xiàn),使得 DNA甲基化研究受到廣泛關(guān)注,從 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到動(dòng)植物研究當(dāng)中,同時(shí)在研究方法上也取得 了很大的突破.現(xiàn)在用于 DNA甲基化檢測(cè)的方法大概有十多種,從應(yīng)用上來(lái)分,大致可以分成兩類： 全基因組甲基化分析及特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè).下面,我們就 這兩大類檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析比擬,以便于在實(shí)際的科研工作 中進(jìn)行選擇.一、全基因組甲基化檢測(cè)技術(shù)1 .基于芯片平臺(tái)的全基因組甲基化篩選芯片平臺(tái)作為目前比擬成熟

2、的篩選工具,已經(jīng)在很多領(lǐng)域有了相應(yīng)的應(yīng)用.多家芯片公司在DNA甲基化這塊兒有了相應(yīng)的產(chǎn)品提供,其中應(yīng)用最為廣泛的就Agilent 平臺(tái)和Illumina 平臺(tái),相應(yīng)的產(chǎn)品包括 Agilent文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用Human CpG Island MicroarrayKit , Infinium HumanMethylation27 BeadChip 和 Infinium HumanMethylation450KBeadChipo 另夕卜 Roche NimbleGen 和 Affymetrix 也有相應(yīng) 的芯片推由,但是 NimbleGen的芯片今年下半年已經(jīng)停產(chǎn).不同的芯片平臺(tái),各自的實(shí)驗(yàn)過(guò)程也是

3、不一樣的.安捷倫前 期采用的甲基化 DNA&疫共沉淀MeDIP技術(shù).將基因組 DNAb成兩份,一份用來(lái)做MeDIP,另一份作為對(duì)照.兩個(gè)樣品都標(biāo)記熒光富集的樣品用Cy5標(biāo)記,對(duì)照用Cy3標(biāo)記,然后與芯片雜交.芯片上 每個(gè)探針的Cy5/Cy3強(qiáng)度比 例顯示由該區(qū)域的甲基化程度.安捷倫公司芯片平臺(tái)因其強(qiáng)大的eArray探針設(shè)計(jì)平臺(tái),可以進(jìn)行芯片的定制.在甲基化領(lǐng)域同樣適用.Agilent平臺(tái)由于MeDIP技術(shù)本身的特點(diǎn),都不能到達(dá)單堿 基的分辨率,而 Illumina 的Infinium 和GoldenGate檢測(cè)文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用技術(shù)卻做得到.Illumina 的Infinium 甲基化檢

4、測(cè)技術(shù)來(lái)源與前期的 SNP僉測(cè),采用的是單堿基延伸的原理.分析利用兩個(gè)位點(diǎn) 特異的探針檢測(cè)這些序列差異的位點(diǎn),一個(gè)探針是為甲基化位點(diǎn) M磁珠類型設(shè)計(jì)的, 而另一個(gè)是為未甲基化位點(diǎn) U磁珠類型設(shè)計(jì)的.探針的單 堿基延伸摻入了一個(gè)標(biāo)記的 ddNTp它隨后被熒光試劑染色.通過(guò)計(jì)算甲基化與未甲基化位點(diǎn)的 熒光信號(hào)比例,可確定檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化水平.Illumina 公 司早期推由的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆蓋27,578個(gè)CpG位點(diǎn).這款芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域有廣泛的應(yīng)用,除了和腫瘤相關(guān)的甲基化篩選之外,也能 用于其他疾病相關(guān)甲基化檢 測(cè).因此對(duì)這款產(chǎn)品,研究者

5、給予了很高的評(píng)價(jià),目前此產(chǎn) 品已停產(chǎn),取而代之的是 Infinium HumanMethylation450BeadChip芯片.它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過(guò)45萬(wàn)個(gè)甲基化位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的全面覆蓋.止匕外,還包括CpG島之外的CpG 位點(diǎn),在人類干細(xì)胞中鑒定由的非CpG甲基化位點(diǎn),以及腫瘤和正常組織中差異表達(dá)的甲基化位點(diǎn)等等.它的高覆蓋度、 高通量以及低價(jià)格,讓它成為進(jìn)行全基因文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用甲基化篩選的有力武器.相比之下,VeraCodeGoldenGate甲基化分析技術(shù)更適合中通量的篩選及驗(yàn)證研究,它以以矩陣微珠芯片 (Sentrix ArrayMatrix(SAM)

6、形式分析 48至384個(gè)用戶指定的 CpG位點(diǎn).首先,將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA與分析oligo混合,oligo與未甲基化位點(diǎn)的 U互補(bǔ),或者 與甲基化位點(diǎn)的C互補(bǔ).雜交之后,引物延伸,并連接上位 點(diǎn)特異的oligo來(lái)產(chǎn)生通用PCR的模板.最后,用標(biāo)記的PCR弓I物生成可檢測(cè)的產(chǎn)物.據(jù)Illumina 的產(chǎn)品專家介紹,其產(chǎn)品的最大優(yōu)勢(shì)在于單個(gè)CpG位點(diǎn)的分辨率.其它分析將甲基化定位在一段區(qū)域,而通過(guò) Illumina 分析,你能精確 測(cè)定某個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平.2 .基于高通量測(cè)序平臺(tái)的甲基化圖譜分析隨著二代測(cè)序技術(shù)的告訴開展,測(cè)序本錢大幅度下降,使得 真正實(shí)現(xiàn)全基因組甲基化分析的研究

7、成為可能.隨著人類甲 基化圖譜繪制成功,已經(jīng)陸續(xù)有多個(gè)物種的甲文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用基化圖譜構(gòu)建完成.研究者將傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測(cè)方法,如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測(cè)序相結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)單堿基精 度的甲基化圖譜的構(gòu)建.此外將成熟的MeDIP技術(shù)與二代測(cè)序相結(jié)合,可以快速有效地尋找基因組 上的甲基化區(qū)域,從而比擬不同細(xì)胞、組織、甚至疾病樣本 間的DNA甲基化修飾模式的差異.因此該技術(shù)也特別適用于大樣本量的疾病表觀研究.第三代測(cè)序技術(shù)的由現(xiàn),更是讓甲基化的直接測(cè)定成為可 能.一年前,美國(guó) Pacific Biosciences公司利用獨(dú)有的單分子實(shí)時(shí)SMRT測(cè)序技術(shù),直接測(cè)定了 DNA勺甲基化.這項(xiàng) 成果發(fā)

8、表在?Nature Methods »雜志上.二、特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用比擬1 .甲基化特異性 PCRMS-PCRDNA&亞硫酸氫鹽作用后,DNACpG假設(shè)無(wú)甲基化,那么序列中的 C改變?yōu)閁,假設(shè)有甲基化那么保持不變,因此從理論上講,用不同的引物做PCR即可檢測(cè)文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用由這種差異,從而確定基因有無(wú) CpG島甲基化.因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變,就可以相應(yīng)設(shè) 計(jì)M和U引物,有時(shí)我們需要設(shè)計(jì)兩輪引物.這種方法靈敏度高,無(wú)需特殊儀器,因此經(jīng)濟(jì)實(shí)用,是目 前應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法.不過(guò)也存在一定的局限性,預(yù) 先需要知道待測(cè)片段的 DNA列,引物的設(shè)計(jì)非常重要.另 外,亞

9、硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵,假設(shè)處理不完全那么可能導(dǎo)致 假陽(yáng)性的由現(xiàn).2 .亞硫酸氫鹽測(cè)序 PCR(BSP)這種方法一度被認(rèn)為是 DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn).它的過(guò)程 如下：經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCRT增目的片段,并對(duì)PCRT物進(jìn)行克隆測(cè)序,將序列與未經(jīng)處理的序列進(jìn)行比擬,判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化.這種方法可靠,且精確度高,能明確目的片段中每一 個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),但由于涉及到測(cè)序,其結(jié)果準(zhǔn)確但要求克隆時(shí)所挑克隆較多,操作繁瑣, 不易大批量操作.另外,甲基化程度的定量依賴于挑選克隆 的數(shù)目,因此這種方法只能算得上是一種半定文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用量的技術(shù)方法目前一般會(huì)先用 BSP找到

10、甲基化位點(diǎn),然后根據(jù)甲基化位 點(diǎn)設(shè)計(jì)MS用I物,進(jìn)行相應(yīng)PCR條件摸索,以用于大量樣本 的篩選.3 .甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析 (MS-HRM)通過(guò)熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異,因此 DNA羊本經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后,甲基化與 未甲基化DNL存在序列差異,這種差異可通過(guò)熔解曲線分析來(lái)發(fā)現(xiàn).使用該方法進(jìn)行甲基化分析僅需 一對(duì)引物,相對(duì)簡(jiǎn)單,不過(guò)這種方法對(duì)儀器的要求頗高,需 要帶HRM莫塊的熒光定量 PCR儀,并且在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCRS程中,需要使用飽和的熒光染料.利用MS-HR峨術(shù)進(jìn)行甲基化檢測(cè)只能對(duì)檢測(cè)片段整體甲基化情況進(jìn)行分析,并不能明確每個(gè) CpG位點(diǎn)的甲基

11、化狀態(tài).因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測(cè),篩 選由感興趣的CPG&點(diǎn),然后利用其他方法進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)的 精確檢測(cè)及甲基化程度的精確定量.文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用4 .聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法COBRA這種方法是將亞硫酸氫鹽處理與酶切相結(jié)合來(lái)進(jìn)行甲基化檢測(cè).DNA羊本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,利用PCRT增.擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶BstUI 消化.假設(shè)其識(shí)別序列中的 C發(fā)生完全甲基化5mCG5mCG那么 PCRT增后保存為CGCG BstUI能夠識(shí)別并進(jìn)行切割；假設(shè)待測(cè)序列中, C未發(fā)生甲基化, 那么PC所轉(zhuǎn)變?yōu)門GTGBstUI識(shí)別位點(diǎn)喪失,不能進(jìn)行切割. 這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳別離、探

12、針雜交、掃描定量后即可計(jì)算由原樣本中甲基化的比例.這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是相對(duì)簡(jiǎn)單,可進(jìn)行快速定量,且 需要的樣本量少.然而,它的局限性也十清楚顯,只能獲得 特殊酶切位點(diǎn)的甲基化情況,且陰性結(jié)果并不能排除樣品 DNA中存在甲基化的可能.5 . 熒光定量法Methylight 這種技術(shù)是在 MS限術(shù)上開展起來(lái)的,在 MSPT增過(guò)程中利文案大全標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用用熒光染料進(jìn)行定量.TaqMan?探針法的應(yīng)用使得該技術(shù)具有更高的精確性.其原理與SNP檢測(cè)類似,針對(duì)亞硫酸氫鹽處理之后的DNA>t段,在甲基化位點(diǎn)上會(huì)存在單堿基的差異,根據(jù)這種差異進(jìn)行探針設(shè)計(jì),隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR就能夠檢測(cè)甲基化的差異.這種

13、方法最大的優(yōu)勢(shì)在于其高敏感性和較高通量,且無(wú)需在PC所電泳、雜交等操作,減少了污染和操作誤差.但是TaqMan?探針訂購(gòu)費(fèi)用較高,適 用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本篩選.6 .焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)隨著技術(shù)的不斷改良,現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing )是甲基化檢測(cè)新的金標(biāo)準(zhǔn).焦磷酸測(cè)序 作為一種新的序列分析技術(shù),能夠快速地檢測(cè)甲基化的頻率,對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性及定量 檢測(cè),為甲基化研究提供了新的途徑.在序列延伸過(guò)程中, 根據(jù)C和T的摻入量來(lái)定量確定單個(gè)位點(diǎn)的C-T比例.因此,不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測(cè), 并給由精確的甲基化程度的數(shù)據(jù).文案大全標(biāo)準(zhǔn)

14、實(shí)用QIAGE心司在焦磷酸測(cè)序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢(shì),目前提供三種焦磷酸測(cè)序儀器,通量由低到高,適合不同的應(yīng)用.PyroMark Q24的強(qiáng)項(xiàng)在于可對(duì)多達(dá) 24個(gè)樣品進(jìn)行焦磷酸測(cè)序.需要大樣 品量的應(yīng)用更適合在 PyroMark Q96 ID上進(jìn)行.在考慮到處理成百上千個(gè)樣品所需的大量試劑時(shí), 運(yùn)行通量最大化可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)本錢變得很高.而 PyroMarkQ96MDg有一臺(tái)高度靈敏的光檢測(cè)攝像頭,可以在減少試劑量的情況下對(duì)少量的 DNA莫板進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序.這些不同平臺(tái)的推 出,對(duì)于我們實(shí)際研究提供了更有效的檢測(cè)手段.雖然焦磷酸測(cè)序可以進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)甲基化程度的精確定量, 但是目前來(lái)看,測(cè)序的片段長(zhǎng)度還比擬短,只有一百多bp,其中有效長(zhǎng)度約為60bp.以上是對(duì)幾種常用的特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)方法進(jìn)行了介紹及比擬,還有一些檢測(cè)技術(shù)是在常