應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式檢測正常核型急性白血病患者的易位相關(guān)融合基因

1、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式檢測正常核型急性白血病患者的易位相關(guān)融合基因馬力，薛永權(quán)，潘金蘭，何軍，吳亞芳，岑建農(nóng)，溫丙昭【摘要】為了探討逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式在檢測具有正常核型的急性白血病(AL)患者的易位相關(guān)融合基因中的價(jià)值，應(yīng)用包括19種染色體易位特異性引物對的逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式對37例常常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方式揭露為正常核型的AL患者進(jìn)行了檢測。結(jié)果說明：有8例()AL患者另IJ離檢測出有PML/RARA、AML1/ETO、CBFB/MYH11和BCR/ABL等4種融合基因的存在。結(jié)論：逆轉(zhuǎn)錄多重PCR可在核型正常的AL患者中檢出隱匿的染色體易位，故凡常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯示為核型正常的AL患者，均應(yīng)

2、付其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測?！娟P(guān)鍵詞】急性白血病DetectionofFusionGenesAssociatedwithSpecificTranslocationsinAcuteLeukemiaPatientswithNormalKaryotypesbyUsingMultiplexRT-PCRAbstractThisstudywasaimedtoexploretheusefulnessofmultiplexreversetranscription-polymerasechainreaction(multiplexRT-PCR)indetectionoffusiongenesassociate

3、dwithspecifictranslocationsinacuteleukemia(AL)patientswithnormalALpatientswithnormalkaryotypeswereanalyzedbymultiplexresultsshowedthat4typesoffusiongenessuchasPML/RARA,AML1/ET0,CBFP/MYH11,BCR/ABLweredetectedin8%)patientsbymultiplexconclusion,multiplexRT-PCRisusefulindetectionoffusiongenesassociatedw

4、ithspecifictranslocationsinacuteleukemia(AL)withnormalkaryotypesanditwouldrefinethekaryotypeanalysis.Whenthenormalkaryotypesweredetectedinacuteleukemiapatientsbyconventionalcytogeneticmethod,themultiplexRT-PCRshouldbeperformedforthem.KeywordsMultiplexRT-PCR;Acuteleukemia;Normalkaryotype研究說明，細(xì)胞遺傳學(xué)和分子

5、遺傳學(xué)在急性白血病(AL)的診斷分型，判定預(yù)后和指導(dǎo)醫(yī)治中占有重腹地位，可是仍有一些AL患者常常規(guī)核型分析未能檢出異樣染色體改變，例如正常核型檢出率在B-細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)、T-細(xì)胞ALL(T-ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)中別離達(dá)到10%-25%3096-40%和40%-47%這是由于常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)對小于1條帶的微小染色體改變不靈敏的緣故。最近幾年來，國內(nèi)外已有假設(shè)干報(bào)導(dǎo)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR技術(shù)(multiplexreversetranscription-polymerasechainreaction)能夠挑選具有隱匿性染色體易位的AL患者。為了評(píng)估所謂正常核型的AL

6、患者中隱匿性染色體易位的頻率和逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測隱匿性染色體易位的價(jià)值,咱們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR對一組37例常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)證明為核型正常的AL患者進(jìn)行了研究。材料和方式病例選擇2004年3月至2004年10月來蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就醫(yī)的急性白血病患者共37例,其中男19例,女18例,年齡11-80歲，中位年齡歲。所有病例均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色和免疫表型確診，別離為Ml9例，M27例，M35例，M43例，M59例，M61例，T-ALL2例，混合性急性白血病(B淋系，髓系)1例。所有病例在初診時(shí)均做了染色體核型分析，同時(shí)抽取患者骨髓1-5ml,肝素抗凝后置-80冰箱保留，備做逆轉(zhuǎn)錄多重

7、PCR。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方式采納骨髓短時(shí)間培育法，按常規(guī)制備染色體。應(yīng)用R顯帶方式進(jìn)行核型分析，核型異樣按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN）19954加以描述。每例至少分析20個(gè)中期細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式要緊試劑與儀器RNA提取試劑TRIZOLreagent購自美國Gibco/BRL公司。Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、TaqDNA聚合酶購自美國AmershamPharmaciaBiotech公司。PCR引物由上海生工生物工程方式效勞合成。PCR擴(kuò)增儀為美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品。RNA提取TRIZOLReagent產(chǎn)品說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反映按MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶

8、產(chǎn)品說明，采納6-隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。多重巢式聚合酶鏈反映(multiplexnestedPCR)設(shè)立8組平行PCR反映，別離利用1-8組多重PCR引物，引物參照文獻(xiàn)5。采納普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)子結(jié)合因子基因(E2A)mRNA作為陽性內(nèi)對照。每組檢測的融合基因包括：I組：inv(16)(pl3q22)WCBF3/MYHU；t(6;U)(q27;q23)的MLL/AF6；t(ll;19)q23;的MLL/ELLII組:t(l;ll)(p32;q23)WMLL/AFlp；t(10;ll)(pl2;q23)的MLL/AF10；dupMLL(llq23)的MLL(llq23)III組:

9、t(l;19)(q23;pl3)的E2A/PBX1；t(12;21)(pl3;q22)的TEL/AML1IV組：t(3;21)(q26;q22)的AML1/MDS1；t(8;21)(q22;q22)AMLl/ETO；t(16;21)(pll;q22)的TLS/ERGV組:t(l;U)(q21;q23)的MLL/AFlq；t(4;ll)(q21;q23)的MLL/AF4；t(9;ll)(p22;q23)的MLL/AF9；t(11;19)(q23;的MLL/ENLVI組：t(9;22)(q34;qll)的BCR/ABLVD組：t(6;9)(p23;q34)的DEK/CANVBI組:t(ll;17)

10、(q23;q21)的PLZF/RARA；t(15;17)(q21;q22)的PML/RARA巢式第1輪PCR：25Hi體系中，含有10X緩沖液nl,25mmol/LMgC12U1,10mmol/LdNTPU1。第1-8組第1輪多重PCR弓I物5pmol/band共Hi,cDNAH1,TaqDNA聚合酶U。PCR條件為：955分鐘，95變性30秒，58退火30秒，72延伸1分鐘。共25個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物置4保留。巢式第2輪PCR：25口1體系中，含有10義緩沖液U1,25mmol/LMgC12Ul,10mmol/LdNTPU1。第b8組第2輪多重PCR引物pmol/band共Hi,第1輪產(chǎn)物Ul,Ta

11、qDXA聚合酶UoPCR條件為：955分鐘，95變性30秒，58退火30秒，72延伸1分鐘。共25個(gè)循環(huán)，然后72延伸10分鐘，產(chǎn)物置4c保留。分離PCR：每組PCR中均包括數(shù)對引物，因此，可能顯現(xiàn)的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)量亦有數(shù)種，且這些畸變的陽性擴(kuò)增條帶的大小可能很接近。為此,設(shè)立分離PCR以分辨某一條帶究竟代表哪一種染色體結(jié)構(gòu)畸變，即對顯現(xiàn)陽性條帶的多重PCR組，按所含引物對數(shù)設(shè)立2-5個(gè)PCR,利用第2輪多重PCR引物（lOpmol）擴(kuò)增一種畸變的一對引物，PCR反映條件與第2輪PCR相同。電泳和掃描采納g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后陽性擴(kuò)增條帶用凝膠電泳分析系統(tǒng)分析。結(jié)果染色體核型分析3

12、7例均為正常核型。男性為46,XY,女性為46,XX。逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測經(jīng)2輪巢式PCR反映，例1-4.例五、例6-7、例8別離顯現(xiàn)R八、R4、R1和R6陽性條帶(圖A),后經(jīng)分離PCR檢測別離存在R8C,R4A,R1A和R6A陽性條帶(圖B)。因此證明在37例AL患者中，8例(%)別離被檢出存在PML/RARA,AML1/ET0,CBFB/MYH11和BCR/ABL等4種融合基因異樣，其中例1-5初診相同均為M3,但染色體核型分析卻是正常核型，未發(fā)覺M3最多見的t(15;17)異樣。而經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測發(fā)覺例1-4具有PML/RARA融合基因，但例5卻具有AML1/ET0融合基因。例6

13、-7診斷為M4E0,染色體核型分析顯示為正常核型，而逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測顯示具有CBF/MYH11融合基因。例8診斷為M2,常規(guī)核型分析也是正常,但逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測顯示具有BCR/ABL(ela2)融合基因。其余29例經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測結(jié)果均為陰性，未檢測出易位相關(guān)融合基因。37例患者的一樣情形及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附表。Table.KarytypeanalysisandmultiplexPT-PCRresultsof37patientswithacuteleukemia(略)討論最近幾年來，應(yīng)用RT-PCR方式檢測AL融合基因的報(bào)導(dǎo)日趨增多，因其具有較高的靈敏度和特異度，為科研及臨床普遍應(yīng)用。

14、可是該方式一次只能檢測出一種融合基因，逆轉(zhuǎn)錄多重PCR一次能檢測多種融合基因，由于擴(kuò)大了基因檢測覆蓋面，因此提高了隱匿性染色體易位的檢出率，受到臨床和研究人員的青睞?？墒?，針對具有正常核型的AL患者逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測，國內(nèi)目前還未見報(bào)導(dǎo)。咱們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式對37例常常規(guī)核型分析未檢出染色體異樣的AL患者進(jìn)行檢測，發(fā)覺8例()存在特異性染色體易位相關(guān)的融合基因異樣，其中例1-4具有PML/RARA基因，例6-7具有CBF8/MYH11基因，例5經(jīng)形態(tài)學(xué)，組織化學(xué)染色及免疫分型診斷為M3,經(jīng)亞碑酸醫(yī)治成效差，1個(gè)療程醫(yī)治后患者未能減緩，后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測發(fā)覺存在AML1/ET0基

15、因，從而糾正了最初的診斷。另外1例AL患者診斷為M2,經(jīng)2個(gè)療程化療患者未能減緩，確診4個(gè)月后死亡。該患者盡管核型正常，但經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測，發(fā)覺存在BCR/ABL(ela2)基因，即屬于Ph+AL,其因此預(yù)后不良也就取得了說明。國內(nèi)外大量研究以為，存在特異性染色體改變或融合基因如t(8;21)或AML1/ETO,t(15;17)或PML/RARA,inv(16)或CBFB/MYH11的AL患者預(yù)后較好，而具有正常核型的AL患者預(yù)后中等。事實(shí)上具有正常核型的AL患者在遺傳學(xué)上也是不均一的:有的在基因水平上存在著特異性染色體易位,有的存在著基因突變，例如Flt3突變,c-kit突變，AML1

16、突變等6-8o真正不伴有基因改變的正常核型患者只占其中的一部份。因此，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR對其進(jìn)行檢測以便將它們進(jìn)一步細(xì)分為不同預(yù)后的類型而給予相應(yīng)的醫(yī)治，是十分必要的。逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式能夠快速有效的檢測AL的基因改變，為核型分析提供了重要補(bǔ)充。本研究顯示，PML/RARA和CBFB/MYH11是本組正常核型AML患者中檢出最多的融合基因。這說明t(15;17)和inv(16)是兩種很容易為常規(guī)核型分析漏檢的易位，可能由于inv(16)是一種微小的染色體異樣,而M3的割裂相質(zhì)量通常較差,染色體短小,帶紋不清的緣故。由于逆轉(zhuǎn)錄多重PCR能在正常核型患者中檢出隱匿性染色體易位，因此咱們以為，對

17、初診時(shí)具有正常核型的AL患者均應(yīng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測。鑒于本研究中要緊發(fā)覺PML/RARA,AML1/ET0,CBFP/MYH11和BCR/ABL這4種融合基因，專門是前3種為AML中最多見的與好的預(yù)后相關(guān)的易位，而后1種為成人ALL最多見的與不良預(yù)后相關(guān)的易位，因此咱們以為，用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測時(shí)只需檢測這4種融合基因，以達(dá)到提高效率和減少本錢的目的。固然，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方式也有其局限性。因其目前一次最多只能檢測29種融合基因，檢測結(jié)果陽性固然能夠幫忙診斷，檢測結(jié)果陰性也不能完全排除存在其他基因異樣，包括基因突變的可能性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】IPreissBS,KerndrupGB,Sc

18、hmidtKG,etfindingsinadultdenovoacutemyeloidpopulation-basedstudyof303/337JHaemetol,2003;123:219-2342薛永權(quán)，過宇，吳亞芳等.1058例急性非淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞遺傳學(xué)分析.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2001;18:247-2503RowleyJD,ReshmiS,CarlsonK,etkaryotypeanalysisofT-cellacute,1999;93:2038-20424MitelmanIntermationalSystemforHumanCytogenetic，19955PallisgaardN,HoklandP,RiishojDC,etreversetranscription-polymerasechainreactionforsimultaneousscreeningof29translocationsandchromosomalaberrationsinacu