2熒光探針設(shè)計(jì)原理

1、熒光化學(xué)傳感器是建立在光譜化學(xué)和化學(xué)波導(dǎo)與量測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上的 將分析對(duì)象的化學(xué)信息以熒光信號(hào)表達(dá)的傳感裝置。 其主要組成部件 有三個(gè)（圖1. 1）: 1.識(shí)別結(jié)合基團(tuán)（R）,能選擇性地與被分析物結(jié)合， 并使傳感器所處的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變。 這種結(jié)合可以通過(guò)配位鍵，氫 鍵等作用實(shí)現(xiàn)。2.信號(hào)報(bào)告基團(tuán)（發(fā)色團(tuán)，F(xiàn)）,把識(shí)別基團(tuán)與被分析 物結(jié)合引起的化學(xué)環(huán)境變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀子^察到的輸出信號(hào)。信號(hào)報(bào)告 基團(tuán)起到了信息傳輸?shù)淖饔?，它把分子水平上發(fā)生的化學(xué)信息轉(zhuǎn)換成 能夠?yàn)槿烁兄伾兓┗騼x器檢測(cè)的信號(hào)（熒光等）。3 .連接基團(tuán)（S）, 將信號(hào)報(bào)告基團(tuán)和識(shí)別結(jié)合基團(tuán)連接起來(lái)， 根據(jù)設(shè)計(jì)的不同連接基團(tuán) 可有多

2、種選擇，一般用做連接基團(tuán)的是亞甲基等短鏈烷基。 連接基團(tuán) 的合適與否將直接影響是否有輸出信號(hào)的產(chǎn)生。信號(hào)表達(dá)可以是熒光 的增強(qiáng)或減弱、光譜的移動(dòng)、熒光壽命的變化等。圖1.1熒光探針的結(jié)構(gòu)1.1.1 熒光探針的一般設(shè)計(jì)原理 （1）結(jié)合型熒光探針21AnalyteSignallingBindingsubunit Space subunitOutput signal圖1.2共價(jià)連接型熒光探針結(jié)合型熒光探針是利用化學(xué)共價(jià)鍵將識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)連接 起來(lái)的一類(lèi)熒光探針，是比較常見(jiàn)的一類(lèi)熒光探針。該類(lèi)探針通過(guò)對(duì) 比加入分析物前后熒光強(qiáng)度的變化、光譜位置的移動(dòng)或熒光壽命的改 變等實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的檢測(cè)。在該類(lèi)熒

3、光化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì)中，必須充 分考慮下列三個(gè)方面的因素。（a）受體分子的熒光基團(tuán)設(shè)計(jì)、合成： 考慮到用于復(fù)雜環(huán)境體系的熒光檢測(cè)，要求熒光基團(tuán)要有強(qiáng)的熒光（高熒光量子產(chǎn)率，有利于提高檢測(cè)的靈敏性），Stokes位移要大（可 有效消除常規(guī)熒光化合物如熒光素等具有的自猝滅現(xiàn)象），熒光發(fā)射 最好要在長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)（最好位于500 nm以上，可避免復(fù)雜體系的常位 于短波長(zhǎng)區(qū)的背景熒光的干擾，另外由于長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)發(fā)射的熒光能量的 降低可減少熒光漂白現(xiàn)象的發(fā)生而延長(zhǎng)傳感器的使用壽命）。（b）受 體分子的識(shí)別基團(tuán)：受體分子的識(shí)別基團(tuán)設(shè)計(jì)以軟硬酸堿理論、配位作用以及超分子作用力（如氫鍵、范德華力等）作為理論指導(dǎo)，多選 擇

4、含氮、硫、磷雜環(huán)化合物作為識(shí)別分子。（c）熒光超分子受體的組 裝：組裝熒光超分子受體就是利用一個(gè)連接基將識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵連接在一起，要充分考慮到識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)之間能通過(guò)連接基進(jìn)行信號(hào)傳遞，對(duì)識(shí)別對(duì)象的識(shí)別信息（如熒光的增強(qiáng)或減 弱、光譜的移動(dòng)、熒光壽命的變化等）可以及時(shí)傳遞出去圖1.3共價(jià)連接型鋅離子熒光探針De Silva在1997年報(bào)道的化合物1 22是一個(gè)典型的共價(jià)連接法設(shè)計(jì)的熒光探針。它分別以有優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)的意作為熒光基團(tuán)， 以對(duì) Zn2+有特異性識(shí)別的基團(tuán)雙（2-毗咤甲基）氨（DPA）為識(shí)別基團(tuán)，通過(guò) 亞甲基將識(shí)別基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)連接在一起。通過(guò)對(duì)比加鋅前后熒 光強(qiáng)

5、度的不同實(shí)現(xiàn)了對(duì)鋅離子的檢測(cè)。（2）置換型熒光探針Receptor bound with anReceptor bound wltli ah Fm由 indicatorMdltatordr) Ion圖1.4置換型熒光探針利用該方法設(shè)計(jì)的熒光探針是通過(guò)識(shí)別基團(tuán)分別與熒光指示劑 和被分析物結(jié)合能力的強(qiáng)弱來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)被分析物的檢測(cè)。該類(lèi)傳感器對(duì)識(shí)別基團(tuán)和熒光指示劑的要求都比較高，既要選擇能和識(shí)別基團(tuán)結(jié)合 但結(jié)合能力又不是特別強(qiáng)的熒光指示劑，又要設(shè)計(jì)對(duì)被分析物能特異 識(shí)別的識(shí)別基團(tuán)。該類(lèi)設(shè)計(jì)方法多用于陰離子傳感器的設(shè)計(jì)。2002年，Kim小組23設(shè)計(jì)了鄰苯二酚紫作為熒光指示劑，雙鋅 配合物為HPO42-識(shí)

6、別基團(tuán)，并將二者自組裝成化合物 2,用于中性 條件下水溶液中HPO42檢測(cè)。加入識(shí)別客體HPO42-后，由于HPO42-與雙鋅配位能力強(qiáng)于鄰苯二酚紫，從而把鄰苯二酚紫擠開(kāi)， 使之進(jìn)入溶液，表現(xiàn)為其原來(lái)顏色。在識(shí)別過(guò)程中，溶液顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色，常見(jiàn)的 Ac-、CO32-、NO3-、N3-、CIO4-、S2-、F-、C、 Br-都不影響HPO42-的檢測(cè)，表現(xiàn)出較好的選擇性。O OH圖1.5置換型HPO42-化學(xué)傳感器（3）化學(xué)計(jì)量型熒光探針（chemodosimeter化學(xué)計(jì)量型熒光探針?lè)肿邮抢锰结樂(lè)肿优c識(shí)別客體之間特異 不可逆的化學(xué)反應(yīng)前后產(chǎn)生熒光信號(hào)的不同而對(duì)分析對(duì)象進(jìn)行檢測(cè) 的一類(lèi)探針

7、24。主要包括兩種類(lèi)型：一類(lèi)是目標(biāo)離子和探針?lè)肿影l(fā)生 化學(xué)反應(yīng)后仍舊通過(guò)共價(jià)鍵相連接：另一類(lèi)是目標(biāo)離子催化了 一個(gè)化 學(xué)反應(yīng)（圖1.6）。 +O口 一o n圖1.6化學(xué)計(jì)量法的兩種類(lèi)型一般而言，化學(xué)計(jì)量型熒光探針?lè)肿佣季哂袑?zhuān)一性和不可逆性。盡管這類(lèi)探針已有不少報(bào)道，但由于設(shè)計(jì)較為困難和反應(yīng)不夠靈敏等缺陷而進(jìn)展較為緩慢。3niHi-11 u(i rvMTiil4xlrunglx nimreMciitco2hwjM r? nt5s(n 1)lin (11 = 2)圖1.7氨基酸熒光分子探針Kim和Hong等25設(shè)計(jì)的識(shí)別半胱氨酸及高半胱氨酸的熒光分子探針3,屬于第一種類(lèi)型。他們利用半胱氨酸及高半胱

8、氨酸與醛生成五元曝晚環(huán)或六元曝嗪環(huán)的特異反應(yīng)以及反應(yīng)前后化合物3和4熒光性質(zhì)的顯著差異實(shí)現(xiàn)了對(duì)半胱氨酸及高半胱氨酸的高選擇性檢測(cè)?；衔?26是較早應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)原理實(shí)現(xiàn)檢測(cè)客體的熒光探針，屬于第二種類(lèi)型?；衔?的乙睛溶液中加入汞離子后熒光顯著增強(qiáng)（34彳并紅移，進(jìn)一步用質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生成了脫硫產(chǎn)物6。56圖1.8基于汞脫硫原理的汞離子熒光探針1.1.2 熒光分子探針的響應(yīng)機(jī)理目前，熒光分子探針的響應(yīng)機(jī)理主要有以下幾種：光致電子轉(zhuǎn)移(PET, photo-induced electron transfer) > 分子內(nèi)電荷 轉(zhuǎn)移(ICT, intramolecular charge tra

9、nsfer、熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET, fluorescence resonance energy transfer 等。(1)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移原理(PET)光致電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程。典型的光致電子轉(zhuǎn)移熒光探針體系是由具有電子給予能力的識(shí)別基團(tuán)R通過(guò)連接基團(tuán)S和熒光基團(tuán)相連組成的功能分子。一般情況下，熒光分子探針的識(shí)別基團(tuán)是電子給體，熒光基團(tuán)是電子受體，并且通常情況下多采用含有氨基的基團(tuán)作為識(shí)別基團(tuán)。具體PET工作過(guò)程如下：在識(shí)別基團(tuán)與待測(cè)物種結(jié)合之前，當(dāng)熒光基 團(tuán)受激發(fā)，具有給電子能力的識(shí)別基團(tuán)能夠使其處于最高占據(jù)軌道的

10、 電子轉(zhuǎn)入激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)因電子激發(fā)而空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無(wú)法直接躍遷到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光，導(dǎo)致熒光基團(tuán)的熒光猝 滅。而識(shí)別基團(tuán)與待測(cè)物種結(jié)合之后，由于降低了識(shí)別基團(tuán)的給電子 能力，光致電子轉(zhuǎn)移過(guò)程被減弱或者不再發(fā)生，熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射得到恢復(fù)(如圖1.9)。圖1.9熒光分子光致電子轉(zhuǎn)移的開(kāi)"光”過(guò)程示意圖。由于與待測(cè)物種結(jié)合前后的熒光強(qiáng)度差別很大，呈現(xiàn)明顯的 關(guān)“、肝”狀態(tài)，因此這類(lèi)熒光分子探針又被稱(chēng)為熒光分子開(kāi)關(guān)。PET 熒光分子探針的作用機(jī)制可由前線(xiàn)軌道理論2來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明（見(jiàn)圖1.10）。從圖可以看出，識(shí)別基團(tuán)處于自由態(tài)時(shí)，其 HOMO軌道上的 電子可以向熒光基團(tuán)的HO

11、MO軌道上轉(zhuǎn)移，致使熒光基團(tuán)被激發(fā)到 LUMO上的激發(fā)態(tài)電子不能返回基態(tài)而難以產(chǎn)生熒光，此過(guò)程對(duì)應(yīng) 于發(fā)生PET現(xiàn)象。在識(shí)別基團(tuán)與待測(cè)物種結(jié)合后，識(shí)別基團(tuán)上的 HOMO電子已無(wú)法轉(zhuǎn)移到熒光基團(tuán)的 HOMO軌道上，使PET過(guò)程無(wú) 法進(jìn)行，這時(shí)熒光基團(tuán)的激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)，產(chǎn)生熒光。由此 可見(jiàn)，利用識(shí)別基團(tuán)對(duì)PET過(guò)程的控制可以實(shí)現(xiàn)對(duì)體系熒光發(fā)射狀 態(tài)的調(diào)控。圖1.10光致電子轉(zhuǎn)移機(jī)制機(jī)制的前線(xiàn)軌道理論解釋化合物1是一個(gè)非常典型的PET機(jī)理熒光增強(qiáng)型的例子。鋅離 子不存在時(shí)，由于識(shí)別基團(tuán)中氮原子上的孤對(duì)電子能夠在熒光基團(tuán)受 激發(fā)態(tài)時(shí)占據(jù)激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)因電子激發(fā)而空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無(wú)

12、法直接躍遷到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光， 導(dǎo)致熒光基團(tuán)的熒光 猝滅，即發(fā)生了光致電子轉(zhuǎn)移（PET）。當(dāng)Zn2+存在時(shí)，Zn2+離子與 兩個(gè)毗咤氮及氨基配位，束縛了氮上的孤對(duì)電子，使發(fā)生在氮原子和 熒光團(tuán)之間的PET過(guò)程被禁阻，熒光強(qiáng)度大幅度增強(qiáng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果也 證實(shí)了此過(guò)程。在乙睛溶液中，加入 Zn2+離子之前，化合物1的熒 光量子產(chǎn)率僅為0.01;加入Zn2+離子之后，它的熒光量子產(chǎn)率為0.77, 熒光增強(qiáng)了 77倍。（2）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT ）機(jī)理分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針?lè)肿油ǔＳ筛浑娮踊鶊F(tuán)（電子給體）和缺電子基團(tuán)（電子受體）共鈍相連，形成推 -拉作用的共鈍體系，沒(méi) 有PET探針?lè)肿幽菢用黠@的連接基

13、。也就是說(shuō)熒光團(tuán)F和受體R通 常融合在一起，識(shí)別過(guò)程二者同時(shí)參與。當(dāng)受體結(jié)合被分析物后，作 為受體的供電子部分或拉電子部分的供拉電子能力被改變，整個(gè)共鈍 體系的 電荷重新分布，熒光團(tuán)的推-拉作用被抑制或強(qiáng)化，進(jìn)而導(dǎo) 致吸收光譜、激發(fā)光譜以致發(fā)射光譜發(fā)生紅移或藍(lán)移 （如圖1.11） 27。化合物7 28兩端分別含有?；?、苯并曝噪兩個(gè)強(qiáng)拉電子基和兩個(gè)氨基強(qiáng)供電子基團(tuán)，激態(tài)時(shí)熒光團(tuán)能夠有效地實(shí)現(xiàn)了從供體到受體的整個(gè)體系 電荷分離，是典型的ICT機(jī)理的熒光分子探針。當(dāng)汞離子 存在時(shí)，四氨基識(shí)別基團(tuán)捕獲 Hg2+離子,6, 7位氮的供電子能力大大 減弱，減弱了整個(gè)體系 電荷分離程度，引起吸收波譜和熒光光

14、譜分 別藍(lán)移了 60 nm和92 nm ,熒光顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了 比色及比率型Hg2+離子的檢測(cè)。 intgraction with the donor group圖1.11識(shí)別基團(tuán)分別為電子供體和電子受體的ICT過(guò)程光譜移動(dòng)示意圖（3）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）機(jī)理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指當(dāng)一對(duì)合適的能量給體分子（Donor）和受體分子（Acceptor）相距一定距離（一般為2-5 nm）,且給體的發(fā)射光譜與 受體的吸收光譜能有效重疊時(shí)，處于激發(fā)態(tài)的給體將把一部分或全部 能量轉(zhuǎn)移給受體，使接受體被激發(fā)的過(guò)程。受體可以是熒光物質(zhì)也可 以是只有吸收而沒(méi)有發(fā)射的熒光猝滅劑。根據(jù)F?rster理論，共振能量轉(zhuǎn)移效率可以用式1.5表示29:t=（1.5）1十金 ：Ro 一式中R為兩個(gè)熒光基團(tuán)的距離，R0為F?rster距離（供體-受體之間的 臨界轉(zhuǎn)移距離）。從這個(gè)方程可以看出，即使R的微小變化都會(huì)導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移的效率強(qiáng)烈改變I"26。1一F J圖1.13具有D-A結(jié)構(gòu)的FRET汞離子分子熒光探針利用FRET效率對(duì)距離的強(qiáng)的依賴(lài)性，F(xiàn)RET廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì) 和核酸的結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)研究、分子結(jié)合的測(cè)定等領(lǐng)域30。同樣，能量 共振轉(zhuǎn)移原理也被用于熒