目的基因雙酶切和電泳純化膠回收實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、題目：目的基因雙酶切和電泳純化膠回收一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)雙酶切法獲取目的基因片段的原理和方法；2. 練習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。3. 學(xué)習(xí)核酸瓊脂糖膠回收的原理和方法。二. 實(shí)驗(yàn)原理1. 限制性核酸內(nèi)切酶：生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。由于這種切割作用是在 DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。2. 切割序列：(1) Bam HI切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端：5' ? G J GATCC? 3' 5'? G GATCC?3'3' ? CCTAGt G ? 5' 3'? C

2、CTAG G?5'(2) Eco R I切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端：5' ?GJ AATTC?3' 5' ?G AATTC?3'3' ?CTTAAf G ?5' 3'? CTTAA G?5'3. 為什么要選擇表達(dá)載體質(zhì)粒 pET-28a ?pET原核表達(dá)質(zhì)粒是最有效的原核表達(dá)系統(tǒng)之一。目的基因被 克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體 T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制；表 達(dá)由宿主細(xì)胞提供的 T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。宿主菌帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通過IPTG來啟動(dòng)表達(dá)。充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用

3、于表達(dá) 目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾小時(shí)，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋 白的50%以上。4. 限制性內(nèi)切酶的選擇：選擇BamHI、Notl兩個(gè)位點(diǎn)由于實(shí)驗(yàn)中須將質(zhì)粒 pEGFP-N3上所需的目的基因切下并連接到 載體質(zhì)粒pET-28a上，所以選擇的限制酶需滿足以下幾個(gè)要求：一. 選擇兩種在質(zhì)粒 pEGFP-N3和載體質(zhì)粒pET-28a上都有酶切 位點(diǎn)的限制性酶切酶，以保證切下的目的基因和載體質(zhì)粒分別都 有兩個(gè)不同的末端，這樣可以防止：(1) 質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化；(2) 質(zhì)粒與質(zhì)粒、目的基因與目的基因相互自身連接；(3) 質(zhì)粒與目的基因反向連接)二. 兩種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)需滿足：(1)

4、不破壞目的基因；(2) 在質(zhì)粒pEGFP-N3和載體質(zhì)粒pET-28a上都有且只有一 個(gè)酶切位點(diǎn)；(3) 在載體質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)距離盡量短些，并且不破壞載體質(zhì)粒的啟動(dòng)子等關(guān)鍵序列。載體質(zhì)粒pET-28a和質(zhì)粒pEGFP-N3的酶切位點(diǎn)示意圖:&W Ilk ?'. > I ! a'l £*|片+血IQi I#b<17i .Eu 14 331唱.一巒+Xh# I門亦Hind3 IjlTW缽 l<|M| 日tp k-faiNta Ipji：Nd» Inv- IM* Ijh.IlHWni W*iHt1CM»Ejod&Z b

5、piwt-;-Ad ATM EM*Bus ii.rI g :氐*刊.廠r呂J MM 9忙*Tlhlll I.J1MI藝陌I .供坤 PtpG lluai圖一、pET-28a的酶切位點(diǎn)示意圖圖二、質(zhì)粒pEGFP-N3勺酶切位點(diǎn)示意圖HlW1E51671 EGFP'伽 B刪HIXm II Bsp2i I 加 I 加II 伽I0 AGATCTCGAGCAAGCTTCGAATTCT GCA GTCGAC GGTACC GCGGGC CCG GGA TCC ATC GCC ACCATG GTG fiffHTXho Hi/iillil Ml P$t Sa/1如 |&/I36II圖三、pEG

6、FP-N3 MCS多酶切位點(diǎn)示意圖5. 瓊脂糖凝膠回收(1 )在酶切的過程中，除產(chǎn)生我們所需要的目的片段外，還會(huì)產(chǎn)生一些小片段，這些小片段可能會(huì)與載體連接，從而產(chǎn)生干擾，去除這些小片段的最好方法就是進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；(2)不同分子量 的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中 由于泳動(dòng)速度 不一 樣而分離，通過回收可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；(3) 本次實(shí)驗(yàn) 使用試劑盒 進(jìn)行膠回收，按說明書進(jìn)行操作，可以用溶劑使瓊脂糖融化，再經(jīng)過吸附管吸附目標(biāo)DNA沖洗，溶解后得到高純度的目的基因片段。(4) 硅膠樹脂在高鹽離子濃度下可以高效專一的吸附DNA通過離心可將DNA片段沉淀下來，在堿性低鹽濃度下其與DNA的結(jié)合能力會(huì)急劇

7、降低，使用弱堿溶液如 TE (pH8.0 )等可以從硅膠離心柱洗脫得到 純凈的DNA片段；三. 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備1. 實(shí)驗(yàn)材料：已經(jīng)提取好的PEGFP-N3質(zhì)粒，1.5ml塑料離心管若干，EP管架，微量取液器和取液器吸頭，常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、試劑瓶等)，錐形瓶，一次性手套2. 實(shí)驗(yàn)儀器：(1) 恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，10、100、1000卩L取液 器各一支，移液槍頭若干，臺(tái)式高速離心機(jī)，制冰機(jī)，漩渦器；(2) 電泳儀，電泳槽，樣品槽模板(梳子)，有機(jī)玻璃內(nèi)槽，水平儀， 取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。3. 實(shí)驗(yàn)試劑:(1) 目的基因的雙酶切a. 核酸外切酶：Not I Bam

8、 H I酶(置于冰盒中)b. 10X buffer(with BSA) ， ddH2O(2) DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測與純化a. gene Green( DNA染 料)b. 1 x TAE緩沖液c. 上樣緩沖液(6Loading Buffer )(3) 膠回收目的基因片段a.膠回收試劑盒一套，ddH2O四. 實(shí)驗(yàn)方法及步驟1. 目的基因雙酶切a) 分別取兩支0.2mlEP管做上記號(hào)：如;EP管EP管10 x buffer2卩L /10x buffer2卩L /(with BSA)3 卩 l + 3 卩 l ddl12Oth BSA)3 卩 l + 3 卩 l ddNot I1卩LNot I1卩

9、LBam H I2 卩 L / 2(1LBam H I2 卩 L / 2(1LpET-28a15 卩 L / 20(1LPEGFP-N315 卩 L / 20(1Lb）兩個(gè)EP管中分別配置下列的 20 （老師提供）/30卩L（自提）體 系：（本次實(shí)驗(yàn)使用20卩L體系）c）將兩只EP管混勻后瞬時(shí)離心，放入恒溫培養(yǎng)箱37度酶切1h;d）酶切體系（20 卩 L+4 卩 I Loading Buffer/ 30 卩 L+6 卩 I LoadingBuffer ）全部加入點(diǎn)樣孔進(jìn)行電泳（自行配制40ml 1%電泳凝膠液做膠），Marker DNA加5卩l(xiāng)，電泳結(jié)束后對(duì)目的基因片段進(jìn)行 膠回收。切膠前請先

10、稱量裝膠的1.5ml離心管重量并做記錄，標(biāo)記好離心管，裝膠后在進(jìn)行稱量，算出膠的重量；e）切膠時(shí)，帶好護(hù)目鏡。在紫外線燈照射下清晰可見目的基因片段，亮度較高，邊際清晰，回收得到含有目的基因片段的瓊脂膠，稱 重。f）按照回收試劑盒步驟切膠回收所需目的基因片段；g）將提取好的目的基因上交保存；2. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測a）瓊脂糖凝膠板的制備b）稱取0.3g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入 30mL1x TAE緩沖液，微 波爐加熱直至瓊脂糖溶解；c）待膠液冷卻到65度（不燙手為宜）,加入1卩L Gene green混勻， 攪拌器上攪拌排除氣泡，緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機(jī)玻璃槽（插入樣品槽模板梳子）內(nèi)，

11、靜置30min左右，輕輕晃動(dòng)拔出梳子;3. 加樣酶切體系（20 卩 L+4 卩 I Loading Buffer/ 30 卩 L+6 卩 I Loading Buffer ）全部加入點(diǎn)樣孔進(jìn)行電泳（自行配制40ml 1%電泳凝膠液做膠），Marker DNA加5卩l(xiāng)4. 電泳將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的藍(lán)色指示劑移動(dòng)到距離膠板邊沿約12cm處，停止電泳。5. 觀察和拍照將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長為 254nm的紫外燈下，觀察凝膠中 DNA存在處顯示出熒光條帶。五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果A 帶：15000bppEGFP-N3目的基因片段B 帶 lOO

12、OObpC 帶 7500bpD 帶 5000bpE 帶 3000bpF 帶 lOOObpG 帶 250bp圖1雙酶切體系處理pEGFP-N3與pET-28a質(zhì)粒凝膠電泳紫外熒光檢測結(jié)果說明：從左到右依次為:pET-28a、pEGFP-N3、DL15000Maker、pEGFP-N3、DL15000Maker由圖可知，pEGFP-N3泳道呈現(xiàn)為十分清晰的雙條帶，上部為酶切 后的pEGFP-N3質(zhì)粒，下部為目的基因片段，無拖影，無雜帶，說明 目的基因純度較高，數(shù)量較多，前一實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒純度較高。與 Marker比照，酶切理論上會(huì)產(chǎn)生約4000bp和約800bp的條帶，預(yù)期分子量基本符合對(duì)應(yīng)的分子

13、量條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。pET-28a泳道共產(chǎn)生了四條條帶，除了最上層清晰的5000bp條帶，還應(yīng)該出現(xiàn)30bp的條帶，但該條帶由于分子量太小，很有可能 已經(jīng)脫出瓊脂膠，無法在結(jié)果上顯示，所以另外的三個(gè)條帶推測為前 一次實(shí)驗(yàn)提純質(zhì)粒時(shí)混入的RNA或其他雜質(zhì)。切膠時(shí)，帶好護(hù)目鏡。在紫外線燈照射下清晰可見目的基因片 段，亮度較高，邊際清晰，回收得到含有目的基因片段的瓊脂膠，稱 重結(jié)果為約1.1g。膠回收完成后，得到少量溶有目的基因片段的PE管一支。六. 結(jié)果討論與結(jié)論：1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)瓊脂糖電泳紫外熒光檢測結(jié)果可見，各泳道拖影現(xiàn)象不明 顯，pEGFP-N3泳道條帶清晰，無扭曲現(xiàn)象，無雜帶，酶切結(jié)

14、果較 好；pET-28a泳道由于只是切開一個(gè)缺口，理論上只應(yīng)該有一個(gè)清晰 條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期。和Marker對(duì)照分子量符合理論結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，可繼續(xù)用于下一次實(shí)驗(yàn)。2. 討論一：影響酶切效率的因素有哪些？答：DNA的質(zhì)量，限制性內(nèi)切酶活性，酶的用量，酶切時(shí)間，酶切溫度，緩沖液的條件3. 討論二：在實(shí)驗(yàn)操作中，取用酶試劑時(shí)操作應(yīng)注意哪些方面？答：（1）放在冰上使用，讓酶一直處于低溫環(huán)境，保持活性；（2）取用不同的酶時(shí)要換新槍頭，不要污染酶試劑。4. 討論三：實(shí)驗(yàn)操作中，怎樣能使微量的試劑混合均勻？答：（1）加入試劑時(shí)，盡量在管底部加入；（2）可進(jìn)行瞬時(shí)離心。5. 討論四：本次實(shí)驗(yàn)酶切結(jié)果較好，可能是哪些原因？答：（1）在酶切之前，輕柔混勻酶與質(zhì)粒多次， 加快反應(yīng)，提高效率；（2）適當(dāng)延長酶切的時(shí)間，保證反應(yīng)的完成度。（3）前一次提取的質(zhì)粒數(shù)量和質(zhì)量較高， 提高了本次實(shí)驗(yàn)的成功率。6. 討論五：膠回收時(shí)的注意事項(xiàng)？（1）檢測時(shí)用小梳子，減少損耗（2）回收提純時(shí)用大梳子，提高效率（3）稱取膠的重量，是為了確定 PC溶液的質(zhì)量，避免浪 費(fèi)和其他不可預(yù)知的影響。（4）用平衡液處理吸附柱，直接影響后續(xù)的實(shí)