分子生物學(xué)研究法

1、第第 五五 章章分子生物學(xué)研究法本章主要內(nèi)容 一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 二、基因操作的主要技術(shù)原理 三、基因克隆的載體系統(tǒng) 四、基因的分離與鑒定一、 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 1. 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；2. 50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；3. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。 重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件基因工程的主要內(nèi)容或步驟: 1. 從生物有機(jī)體基因組中

2、，分離出帶有目的基因的DNA片段。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5. 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、 基因操作的主要技術(shù)原理 1 核酸的凝膠電泳 將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該

3、分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。 在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極正極移動(dòng)。 在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。2 核酸的分子雜交技術(shù) 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過(guò)毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地吸印 轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯

4、氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。 核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟： 將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法 將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸雜交為印跡雜交。3 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必

5、須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（Competent Cells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。 對(duì)絕大多數(shù)hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ug DNA可得107-108個(gè)轉(zhuǎn)化子。4、分子克隆技術(shù) （1）高質(zhì)量mRNA的制備 應(yīng)用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated Oligo(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場(chǎng)吸附與PMP相連的SA-Biotinylated Oligo

6、(dT)-mRNA。 （2） 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長(zhǎng)cDNA；應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）；應(yīng)選用甲基化dCTP；應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。(一)、限制性核酸內(nèi)切酶的概念 核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來(lái)；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3，5磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細(xì)菌和細(xì)胞中都能識(shí)別外來(lái)的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)榧?xì)菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶,能識(shí)別

7、特定的核酸序列而將核酸切斷;同時(shí)又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見(jiàn)的是甲基化酶,能使細(xì)胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來(lái)核酸沒(méi)有這種特異的甲基化修飾,就會(huì)被細(xì)胞的核酸酶所水解.這樣細(xì)胞就構(gòu)成了限制一修飾體系,其功能就是保護(hù)自身的DNA,分解外來(lái)的DNA,以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定,這對(duì)細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來(lái)。三.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 按酶的來(lái)源的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語(yǔ)表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血

8、桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為Hind、Hind和Hind。(二)限制性核酸內(nèi)切酶的命名按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：類限制性核酸內(nèi)切酶由3種不同亞基構(gòu)成，兼具有修飾酶活性和依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性，它能識(shí)別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，去隨機(jī)切斷在識(shí)別位點(diǎn)以外的DNA序列，通常在識(shí)別位點(diǎn)周圍400-700bp。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。類限制性核酸內(nèi)切酶與類酶相似，是多亞蛋白質(zhì)，既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點(diǎn)在識(shí)別序列周圍25-30bp范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)除

9、Mg2+外，也需要ATP供給能量。類限制性核酸內(nèi)切酶只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識(shí)別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指類酶而言(三)限制性核酸內(nèi)切酶的分類(四)限制性核酸內(nèi)切酶的作用 大部分限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5磷酸基和3羥基末端。不同限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割的特異性不同，結(jié)果有三種不同的情況： 產(chǎn)生3突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 為例： 5GAATT C35GpOHTTAAC3 3C ATAAG5EooP 3 C

10、TTAAOH pG5 產(chǎn)生5突出的粘性末端：以Pst為例： 5CTGCAG35CTGCApOHG3 3GACGTC5Pst 3GOHpACGTC5 產(chǎn)生平末端（blunt end）:Nru 為例： 5TCGCGA35TCGp OHCGA3 3AGCGCT5Nru 3AGCOh pGCT5DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶酶酶 主要用途主要用途限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別識(shí)別DNA特定序列，切斷特定序列，切斷DNA鏈鏈DNA聚合酶聚合酶 或其大或其大片段（片段（Klenow）缺口平移制作標(biāo)記缺口平移制作標(biāo)記DNA探針探針 合成合成cDNA的第二鏈的第二鏈填補(bǔ)雙鏈填補(bǔ)雙鏈DNA3凹端凹端DNA

11、序列分析序列分析耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶（Taq DNA聚合酶聚合酶聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA連接酶連接酶連接兩個(gè)連接兩個(gè)DNA分子或片段分子或片段多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多核苷酸催化多核苷酸5羥基末端磷酸化，制備末端標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，制備末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3末端加入同質(zhì)多聚物尾末端加入同質(zhì)多聚物尾SI核酸酶，綠豆核酸核酸酶，綠豆核酸酶酶降解單鏈降解單鏈DNA或或RNA，使雙鏈，使雙鏈DNA突出端變?yōu)槠蕉送怀龆俗優(yōu)槠蕉薉NA端酶端酶降解降解DNA，在雙鏈，在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶酶A降解除降解除RNA磷酸酶磷酸酶切除核酸末端

12、磷酸基切除核酸末端磷酸基四四 PCR技術(shù)技術(shù)v PCRPCR技術(shù)簡(jiǎn)史技術(shù)簡(jiǎn)史v PCRPCR的基本原理的基本原理v PCRPCR的種類的種類v PCRPCR的特點(diǎn)的特點(diǎn)v PCRPCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) PCR (Polymerase Chain reaction) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,故又稱為基因的體外擴(kuò)增法.可以在試管內(nèi)建立反應(yīng),經(jīng)數(shù)小時(shí)后,就能將極微量的目的基因或特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬(wàn)乃至數(shù)千萬(wàn)倍.無(wú)須通過(guò)煩瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序便可獲得足夠的精確的DNA拷貝,因此有人也將之稱為無(wú)細(xì)胞基因克隆法.PCR的

13、最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。( (一一) PCR) PCR技術(shù)簡(jiǎn)史技術(shù)簡(jiǎn)史PCR的實(shí)現(xiàn) 但是最初采用的DNA聚合酶是Klenow酶,每輪的變性都會(huì)使之失活,需要補(bǔ)充新酶.隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈

14、反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。PCR的改進(jìn)與完善 1988年，Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點(diǎn)：耐高溫，在70反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0

15、Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。(二)PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左

16、右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的子鏈.鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35模板DNA 鏈ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATC

17、G35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5引物酶RNA引物引物酶AUCGCG5RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3DNA聚合酶AUCGCG5ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53GGAUCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35AUCGCG5

18、ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA的變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA的變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)五要素：反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+DNADNA模板模板DNADNA引物引物dNTPdNTPTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶引物： PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用

19、PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。循環(huán)次數(shù):循環(huán)次數(shù)決定了PCR的擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。DNADNA模板模板DNADNA引物引物dNTPdNTPTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶PCRPCR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件3min140s5640s30 x7240s725min1x( (三三)PCR)PCR的種類的種類 1 1單一PCR檢測(cè) Original DNAPrimerNew DNA變性和合成變性和合成例：例：引物序列 actA-F：5-GCT GAT TTA AGA

20、 GAT AGA GGA ACA-3 actA-R：5-TTT ATG TGG TAA TTT GCT GTC-3 PCR擴(kuò)增結(jié)果 1 2 3（注：其它分離株P(guān)CR結(jié)果與此完全一致）1：100bp DNA ladder2：LM SLCC 2755 PCR product3：LM337 PCR product 820bp 巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nPCR)也稱套式PCR。在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第一輪PCR，然后再使用第一對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，所以稱為巢式PCR。引物設(shè)計(jì)的方法是，巢式PCR兩個(gè)引物的起始點(diǎn)分別從目的基因的5端堿基序列和3端的互補(bǔ)堿基序列向中間略有縮進(jìn)

21、；半巢式PCR只是其中的一個(gè)引物縮進(jìn)。在第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物中，能夠產(chǎn)生錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物的可能性是極低的，所以應(yīng)用巢式和半巢式PCR技術(shù)能夠使靶DNA序列得到有效選擇性擴(kuò)增，大大提高了擴(kuò)增的靈敏性和特異性。在一定情況下，這種方法對(duì)減少擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問(wèn)題極為有用，但同時(shí)也增加了每次試驗(yàn)的復(fù)雜性。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約可在第二輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第一輪擴(kuò)增共用，效果也優(yōu)于單次擴(kuò)增。 2 巢式和半巢式PCR巢式和半巢式PCR檢測(cè)3 多重PCR檢測(cè) 單一PCR的快速、簡(jiǎn)便和敏感是人所共知的，然而它存在的問(wèn)題包括反應(yīng)失敗所致的假陰性和污染所致的假陽(yáng)性。為了監(jiān)測(cè)PCR的失敗和假象，我們可以在PCR中

22、使用一對(duì)以上的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即多重PCR。多重PCR的目的是同時(shí)擴(kuò)增目的DNA中的幾個(gè)片段，以節(jié)省模板DNA、時(shí)間并且減少費(fèi)用. 多重PCR檢測(cè)PCR擴(kuò)增基因組DNA電電 泳泳例: 根據(jù)李斯特菌屬iap 基因?qū)俚墓残院头N的特異性設(shè)計(jì)引物,利用三重PCR鑒別各種李斯特菌:引物在基因組中的位置及其序列MonoAUlisALisBUlisA：5-GCT ACA GCT GGG ATT GCG T-3 LisB： 5-TTA TAC GCG ACC GAA GCC AA -3MonoA：5-CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT-3 LisB： 5-TTA TAC GCG ACC

23、 GAA GCC AA -3HA1： 5-GCA GTT GCA AGC GCT TGG AGT GAA-3HA2： 5-GCA ACG TAT CCT CCA GAG TGA TCG-3HA1HA253351250bp750bp420bp三重PCR擴(kuò)增結(jié)果1500bp1200bp700bp500bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1. 100bp DNA Ladder； 2.LM (1/2b)； 3. LM (1/2c)； 4. LM(EGD，1/2a)；5. LM (4a)；6. LM (4b)；7. L. innocua； 8. L. ivanovi.；

24、 9. L. grayi；10. L. seeligeri； 11. L. murrayi；12. L. welshimeri； 13. S. typhymurium TL2；14. S. aureus 750bp420bp1250bp 4 4 隨機(jī)引物PCR(RAPD)PCR(RAPD) 隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析是采用隨機(jī)選擇的單一引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增即能產(chǎn)生復(fù)雜的基因組指紋圖譜的一種DNA多態(tài)性分析技術(shù)。該技術(shù)分別由Welsh和Williams于1990年同時(shí)建立。具有自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：使用隨機(jī)引物，合成引物時(shí)無(wú)需預(yù)知被研究生物的基因組序列； 造作簡(jiǎn)便快速，避免了其它DNA多態(tài)性分析所需

25、的一系列預(yù)備性工作，如篩選探針、制備克隆、多態(tài)性篩選、同位素標(biāo)記和Southern印跡等； RAPD分析所需DNA量少，每個(gè)反應(yīng)只需要幾十個(gè)納克的模板DNA； 每個(gè)RAPD標(biāo)志就相當(dāng)于一個(gè)序列位點(diǎn)，因而這種方法可以使基因型的檢測(cè)自動(dòng)化，可以更有效地進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建。 primerABCRAPD 5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè) 實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)有時(shí)也稱動(dòng)力學(xué)PCR。最早的實(shí)時(shí)PCR儀是用一臺(tái)熒光計(jì)與一臺(tái)PCR儀相連構(gòu)成，測(cè)量由于熒光染料分子的插入或與雙鏈DNA分子相結(jié)合所導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的不同熒光強(qiáng)度。在PCR的指數(shù)增長(zhǎng)階段，每個(gè)循環(huán)合成產(chǎn)物的產(chǎn)量以一種類似幾何級(jí)數(shù)方式增長(zhǎng)。因此，擴(kuò)增D

26、NA的產(chǎn)量可以通過(guò)反應(yīng)管染料中發(fā)射出來(lái)熒光的數(shù)量來(lái)估算。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)法的高靈敏度，實(shí)時(shí)PCR能夠測(cè)量靶DNA的起始濃度相差在5-6個(gè)數(shù)量級(jí)的大范圍。在應(yīng)用熒光染料如SYBRGreen I時(shí)，可檢測(cè)出起始樣品中拷貝數(shù)為的10-100模板DNA。目前，三種最通用的實(shí)時(shí)PCR儀器是GeneAmp5700序列檢測(cè)系統(tǒng)、ABI光譜7700序列檢測(cè)系統(tǒng)和Light Cylcler。實(shí)時(shí)PCR的主要優(yōu)點(diǎn)在于，在一種巨大的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)測(cè)量核酸分子濃度的能力，并且以它的高靈敏度與大容量的并行操作為特征，能同時(shí)檢測(cè)許多樣品。與傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物終點(diǎn)測(cè)量法不同，實(shí)時(shí)PCR提供關(guān)于PCR動(dòng)力學(xué)的瞬間信息；因此， 在不同

27、樣品之間擴(kuò)增效率的差異能夠通過(guò)計(jì)算獲得補(bǔ)償。 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)( (四四) PCR) PCR的特點(diǎn)的特點(diǎn)靈敏度高靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA( (五五) ) PCRPCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用Bubert：根據(jù)iap 基因?qū)俚墓残院头N的特異性設(shè)計(jì)引物， 鑒別各種李斯特菌Bansal：檢測(cè)350多份

28、食品樣品的LM，沒(méi)有一例假陽(yáng)性Karpskova：2000年從990份樣品中分離到63株LMHeina：多重PCR與實(shí)時(shí)PCR相結(jié)合以iap為目的基因， 檢測(cè)人工污染牛奶中LM 和無(wú)害李斯特菌，檢測(cè) 底限為6拷貝 1在病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用 2 2 產(chǎn)生和分析基因突變產(chǎn)生和分析基因突變 PCR技術(shù)十分容易用于基因定位誘變.利用引物可在擴(kuò)增DNA片段的末端引入附加序列,造成堿基取代,缺失和插入.設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)使與模板不配對(duì)的堿基安置在引物中間或是5端,在不配對(duì)的堿基之前至少要有15個(gè)以上的配對(duì)堿基. PCR技術(shù)用于檢測(cè)基因突變的方法十分靈敏.已知人類癌癥和遺傳疾病都與基因有關(guān).用PCR擴(kuò)增可以快速獲得

29、患者所需要檢查的基因片段,再通過(guò)分子雜交檢測(cè)突變;可用特殊的引物,通過(guò)PCR直接判斷. 3 RT-PCR 將反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCRPCR技術(shù)相連, ,可用于擴(kuò)增被反轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA形式的特定RNARNA序列. .在單個(gè)細(xì)胞中少于10copy10copy的特異RNARNA都能用此法擴(kuò)增出來(lái). . RT-PCRRT-PCR主要用于: :分析基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, ,構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù), ,克隆特異cDNA,cDNA,合成cDNAcDNA探針, ,構(gòu)建RNARNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng). .4 基因組序列的比較研究 應(yīng)用隨機(jī)引物PCRPCR擴(kuò)增, ,便能測(cè)定兩個(gè)生物基因組之間的差異. .這種技術(shù)稱為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNADNA分析(RAPD).(