細胞凍存的方法與步驟

1、細胞凍存、解凍方法與細胞計數(shù)江蘇大學附屬醫(yī)院風濕科李晶1返回主頁一、細胞冷凍保存1、材料：生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4 %(w/v) trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10Seriesll)2、冷凍保存方法：(1 )傳統(tǒng)方法：冷存管置于4 C 10分鐘-20 C 30分鐘-80 C 1618小時(或隔夜)- 液氮槽vaporphase 長期儲存。-20 C不可超過1小時，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟

2、直接放入-80 C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。(2) 程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機 以-1-3 C /分鐘之速度由室溫降至(-80 C以下)-120 C,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。3、步驟：(1) 冷凍前24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基，使細胞處于指數(shù)生長期。(2) 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜(DMSO至20% 濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。(3) 離心收集培養(yǎng)之細胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細胞濃度及凍前 存活率。

3、(4) 取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液(DMSOt后濃度為510%)，使細胞濃度為 15x 106cells/ml ，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，12ml/vial ，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數(shù)、日期。然后進行凍存。4、注意事項：(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為8090%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。( 2)細胞在液氮中可長期凍存無限時間，而不會影響細胞活力；在-70 度可保存數(shù)

4、月。(3) 注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSC應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如 Sigma D-2650)，以510ml小體積分裝，4C避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級 ，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍 存液，可避免 DMS(直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細 胞受損。DMS(可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。( 4)冷凍保存之細胞濃度：6 normal human fi

5、broblast:1 3 x 10 cells/ml hybridoma:13x 106cells/ml ，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。6 adhere nt tumor li nes:5 7x 10 ,依細胞種類而異。Ade nocarci noma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需163x 106cells/ml66 other suspensions:510 x 10 cells/ml , human lymphocyte 須至少 5 x 10 cells/ml 。( 5)冷凍保護劑濃度為 5 或 10DMS，O 若是不確定細胞之冷凍條

6、件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backupculture ，以防止冷凍失敗。( 6)凍存可用 10% 90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積( 4 度時)，復蘇存活率在 80% 90%以上，對原代培養(yǎng)細胞，以90%血清凍存更為有效。二、冷凍細胞活化1 、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。2、 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常( 例如產(chǎn)生單株抗體或是其它 蛋白質(zhì) ) 。3、材料37 C恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器4、步驟：

7、( 1 )操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。( 2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。( 3)將新鮮培養(yǎng)基置于 37C 水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。( 4)取出冷凍管，立即放入37C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，以 70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。（稀釋比例為1:101:15），混合均勻，放入 C02（5）取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取 0.1ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如 DMSO或

8、 glycerol），依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即5-10ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心 1000rpm， 5 分去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（ 7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細胞計數(shù)與存活測試1 、原理：（ 1 ）計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是 Coultercounter 粒子計數(shù)器自動計數(shù)。（2）血球計數(shù)盤一般有二個 chambers，每個chamber中細刻9個1mrn大正方形，其中4個角落之正方形再細刻 16個小格，深度均為 0.1mm。當cha

9、mber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mrrix 0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每 ml 中之細胞數(shù)目。（ 3）存活測試之步驟為 dyeexclusion ，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲 入而不會呈色。 一般使用藍色之 trypan blue 染料， 如果細胞不易吸收 trypan blue ，則用紅色之 Erythrosin bluish 計算細胞活率：活細胞數(shù)/ （活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）x 100%計數(shù)應在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分 活細胞也開始攝取染料；因為

10、臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準確。2、材料：0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061） ；Erythosin bluish stain ；取 0.1gram Erythrosin bluish（SigmaE-9259） 及 0.05gram preservative methyl paraben（SigmaH-3647）溶于 100mlCa+/Mg+freesaline ；血球計數(shù)盤及蓋玻片 （Hemocytometerandcoverslip） ；計數(shù)器 （counter） ；低倍倒立顯微鏡；粒子計數(shù)器 （Coulte

11、rcounter,CoulterElectronics）。白細胞稀釋液（ 4%乙酸溶液）。3、步驟：（1 ）取50 l細胞懸浮液與 50 l trypan blue（orErythros in bluish）等體積混合均勻于 1.5ml小離心管中。（2）取少許混合液（約15卩l(xiāng)）自血球計數(shù)盤 chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色 （ 或紅色 -Erythrosin bluish） 。（ 3）計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù) （ 至少乘以 2，因與 trypanblue 等體積混合 ） ，最后乘以 104，即為每 ml 中

12、細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞（ 或計下線與左線之細胞 ） 。注： 4 大格細胞總數(shù) x 稀釋倍數(shù) x 104/4= 細胞數(shù) /ml ；每一大格的體積 =0.1cmx 0.1cmx 0.01cm=10 -4ml計數(shù)板計數(shù)時，最適濃度為510X 105細胞/ml，此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。5、范例：T75 monolayer culture 制成 10ml 細胞懸浮液，取 0.1ml 溶液與 0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少 許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目?；罴毎麛?shù) /方格： 55， 62， 49， 59；死細胞數(shù) /方格： 5， 3， 4， 6；細胞總數(shù)