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文檔簡介

1、病理學(xué)常用研究方法(研究生課程) 病理學(xué)常用研究方法病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)整體水平整體水平:尸體解剖尸體解剖 autopsyautopsy動物實驗動物實驗 animal experimentanimal experiment細(xì)胞水平:細(xì)胞水平:光鏡組織切片光鏡組織切片 light-microscopelight-microscope細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) cell culturecell culture流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù) flow cytometryflow cytometry組織芯片組織芯片 tissue micro-arraytissue micro-array組織微切割技術(shù)組織

2、微切割技術(shù) micro-dissectionmicro-dissection電鏡電鏡 透射、掃描、免疫電鏡透射、掃描、免疫電鏡病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)蛋白水平:蛋白水平:1.1.免疫組化免疫組化 immunohistochemstryimmunohistochemstry2.Western Blotting2.Western Blotting3.3.組織芯片組織芯片 tissue micro-arraytissue micro-array基因水平:基因水平:1.1.原位分子雜交原位分子雜交( (組織、染色體組織、染色體Fish)Fish) in situ hybridization i

3、n situ hybridization2.2.基因芯片基因芯片 gene chipgene chip3.3.組織芯片組織芯片 tissue micro-arraytissue micro-array4.PCR4.PCR及測序等及測序等 PCR and sequencePCR and sequence病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)一、免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化問題探討本世紀(jì)本世紀(jì)7070年代問世年代問世抗體種類急速增加,交叉反應(yīng)存在抗體種類急速增加,交叉反應(yīng)存在免疫組化技術(shù)方法不斷問世免疫組化技術(shù)方法不斷問世使用的試劑或?qū)嶒炇覘l件不同使用的試劑或?qū)嶒炇覘l件不同操作人員的熟練程度操作人員的熟練程度病理醫(yī)生

4、的結(jié)果判定水平及關(guān)聯(lián)知識病理醫(yī)生的結(jié)果判定水平及關(guān)聯(lián)知識解決標(biāo)準(zhǔn)化的問題勢在必行解決標(biāo)準(zhǔn)化的問題勢在必行病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)(一)方法的選擇目前常用的免疫組化方法有:目前常用的免疫組化方法有:PAPPAP、ABCABC、APAAPAPAAP法、法、S-PS-P方法等方法等各種方法只要運用得好,都會得到滿意各種方法只要運用得好,都會得到滿意的結(jié)果的結(jié)果建議:在我們省內(nèi)都采用建議:在我們省內(nèi)都采用S-PS-P法法病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)S-P法的優(yōu)點 方法統(tǒng)一方法統(tǒng)一 有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒 一般一般2-32-3小時小時(3

5、0(30-60-60) ),而,而ABCABC法需法需1 1天,分天,分 子量小子量小(60KD)(60KD),穿透力強,穿透力強 靈敏性高,特異性強,靈敏性高,特異性強,4 4個亞基都能于二抗上的生個亞基都能于二抗上的生 物素結(jié)合,而且結(jié)合鍵強物素結(jié)合,而且結(jié)合鍵強 背景低,非特異性反應(yīng)少,等電點為背景低,非特異性反應(yīng)少,等電點為6.56.5,接近于,接近于 中性,不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合中性,不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合, ,而而ABCABC法為法為1010病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)S-P法與ABC法的區(qū)別S-PS-P法:法:Streptaridin peroxidase conju

6、gataed methodStreptaridin peroxidase conjugataed method 鏈霉菌素抗生物素蛋白鏈霉菌素抗生物素蛋白過氧化物酶連接法過氧化物酶連接法ABCABC法:法: Avidin-Biotin peroxidase complex methodAvidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素親生物素卵白素親生物素過氧化酶復(fù)合物法過氧化酶復(fù)合物法S-PS-P法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了ABCABC方法中的卵白方法中的卵白 素和生物素素和生物素即:卵白素中的即:卵白素中的4 4個亞基一

7、方面與第二抗體上的生物素結(jié)個亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié) 合,另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合合,另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)一一抗抗二二抗抗卵卵白白素素生生物物素素過過氧氧化化物物酶酶A-B-C一一抗抗二二抗抗鏈菌素抗生物素鏈菌素抗生物素蛋白蛋白過氧化過氧化物酶物酶ABCABC法:法:S-PS-P法法:病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)(二) 固定、包埋固定液:一般固定液:一般10%10%中性緩沖福爾馬林,中性緩沖福爾馬林,PH7.3-7.4(PBSPH7.3-7.4(PBS配制配制) )固定時間:應(yīng)少于固定時間:應(yīng)少于2424小時,固定時間越長,小時,

8、固定時間越長,抗原丟失越多抗原丟失越多固定液量或組織塊大?。航M織為固定液量或組織塊大?。航M織為1/31/3,固定,固定液液2/32/3大體標(biāo)本:切下一塊固定大體標(biāo)本:切下一塊固定病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)包埋:包埋:起初免疫組化對蠟溫的要求很起初免疫組化對蠟溫的要求很嚴(yán),溫度一高會嚴(yán)重影響結(jié)果?,F(xiàn)在由于抗嚴(yán),溫度一高會嚴(yán)重影響結(jié)果?,F(xiàn)在由于抗體質(zhì)量的提高,以及抗原恢復(fù)方法的問世,體質(zhì)量的提高,以及抗原恢復(fù)方法的問世,多數(shù)人又忽視了蠟溫的問題。個人認(rèn)為:盡多數(shù)人又忽視了蠟溫的問題。個人認(rèn)為:盡管有抗原修復(fù)方法,但不如開始就不使抗原管有抗原修復(fù)方法,但不如開始就不使抗原破壞,另外,蠟溫過高,

9、組織變脆,不易切破壞,另外,蠟溫過高,組織變脆,不易切成大片,容易脫片。因此,要控制蠟溫在成大片,容易脫片。因此,要控制蠟溫在6565以下以下病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)(三) 抗原修復(fù)(抗原暴露、抗原復(fù)原)組織中存在某種抗原、但用特異性抗體,卻為陰性組織中存在某種抗原、但用特異性抗體,卻為陰性其原因是:其原因是:固定、包埋后部分抗原決定簇與核酸或其它蛋白抗固定、包埋后部分抗原決定簇與核酸或其它蛋白抗原發(fā)生了交聯(lián),形成網(wǎng)絡(luò)原發(fā)生了交聯(lián),形成網(wǎng)絡(luò)固定液中的醛基本身也會發(fā)生交聯(lián),而封閉抗原固定液中的醛基本身也會發(fā)生交聯(lián),而封閉抗原病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)抗原修復(fù)的目的:就是要打開交聯(lián),

10、暴露抗原決定簇,有利于抗原抗體反就是要打開交聯(lián),暴露抗原決定簇,有利于抗原抗體反應(yīng),抗原修復(fù)的方法從大的方面講有兩種應(yīng),抗原修復(fù)的方法從大的方面講有兩種:只限于需要抗原修復(fù)的只限于需要抗原修復(fù)的抗體抗體熱熱微波微波高壓鍋高壓鍋水浴鍋水浴鍋酶消化酶消化胰蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)熱修復(fù): 0.01M0.01M檸檬酸緩沖液,檸檬酸緩沖液,PH=6.0PH=6.0,9595,1010分鐘分鐘注意:注意:脫片多脫片多多聚多聚L L賴氨酸賴氨酸 干片干片 選醫(yī)用微波爐選醫(yī)用微波爐酶消化:1.1.細(xì)胞內(nèi)抗原細(xì)胞內(nèi)抗原0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶 20203737 2

11、. 2.間質(zhì)抗原間質(zhì)抗原4%4%胃蛋白酶胃蛋白酶3737,4-84-8小小時時病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)( (八八) )免疫組織化學(xué)的發(fā)展免疫組織化學(xué)的發(fā)展1. 1. 免疫免疫PCRPCR:主要用于臨床生物分子檢測方面:主要用于臨床生物分子檢測方面 血清血清(Ag)(Ag)電泳電泳+Ab+Ab+無關(guān)引物擴增無關(guān)引物擴增顯色顯色 意義:意義:1. 1. 原來較弱、水平較低的酶等,用免疫原來較弱、水平較低的酶等,用免疫PCRPCR就可以檢測出來就可以檢測出來 2. 2. 需要較長或一定時間才能查出來需要較長或一定時間才能查出來用免疫用免疫PCRPCR法,就可提前查出來法,就可提前查出來如:病

12、毒性心肌炎、血腫如:病毒性心肌炎、血腫CPKCPK檢測檢測 心梗早期心肌酶譜的檢測等心梗早期心肌酶譜的檢測等心梗預(yù)報:心絞痛心梗預(yù)報:心絞痛一般認(rèn)為沒有酶一般認(rèn)為沒有酶 譜改變,設(shè)想用免譜改變,設(shè)想用免疫疫PCRPCR就可能發(fā)現(xiàn)改變就可能發(fā)現(xiàn)改變病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)2. 2. 原位免疫原位免疫PCRPCR在組織切片上有定位在組織切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2Ag+Ab1+Ab2卵白素卵白素洗凈洗凈生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記的的DNADNA片斷片斷洗凈洗凈原位原位PCRPCR擴增擴增洗凈洗凈ACBACB或或S-PS-P顯色顯色 特點:提高陽性率特點:提高陽性率 定位好定位好病理學(xué)常用研

13、究方法(研究生課程)2. 2. 擴增擴增:Total: 25lTotal: 25l PCR buffer 2.5l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l mixed dNTP 2.0l dH dH2 2O 16.375lO 16.375l primer 1 1.0l primer 1 1.0l primer 2 1.0l primer 2 1.0l Taq 0.125l Taq 0.125l DNA template 2.0l DNA template 2.0l94 2594 25” 55 25 55 25” 72 40 72 40” 30 30 cyclescycl

14、es病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)3. Agarose 2-5%3. Agarose 2-5%,用,用1 1TBETBE電泳電泳 擴增后液擴增后液 5l + 1l loading buffer5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色溴化乙淀染色 2020,UVUV照射下確認(rèn)泳帶照射下確認(rèn)泳帶照相照相4. DNA4. DNA收集收集 RECOCHIPRECOCHIP法法病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)三、三、Western BlottingWestern Blotting1. 1. 提取蛋白提取蛋白 500l500l的的hypotonic buffer + hypotonic

15、 buffer + 組織組織2mm2mm3 3勻漿器勻漿器粉碎粉碎 冰上放置冰上放置3030 1500015000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分,分,44,3030。上清:細(xì)胞質(zhì)蛋白,上清:細(xì)胞質(zhì)蛋白,+250l 3+250l 3loading loading bufferbuffer沉淀物沉淀物 + 750l + 750l loading buffer loading buffer再次粉碎、離心,上清為細(xì)胞膜蛋白再次粉碎、離心,上清為細(xì)胞膜蛋白 2-2-氫硫基乙醇?xì)淞蚧掖?7.5l(1/100)7.5l(1/100)混合混合 9595沸騰沸騰5 5分鐘分鐘 冰上放置冰上放置病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)2

16、. 2. 蛋白定量蛋白定量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度制備:標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度制備:BSABSA,0 0,0.50.5,1 1,2mg/ml2mg/ml 比色:測定系數(shù)比色:測定系數(shù) 換算成含量換算成含量 計算出每個樣品加樣量計算出每個樣品加樣量3. 3. 電泳電泳 丙烯酰胺丙烯酰胺 上部膠、下部膠上部膠、下部膠 markermarker樣品樣品4. 4. 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜5. 5. 洗膜洗膜 一抗、二抗一抗、二抗 顯色或自顯影顯色或自顯影病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)四、組織芯片四、組織芯片(Tissue Micro-Array, TMA)(Tissue Micro-Array, TMA) 組織芯片技術(shù)是一種特殊生物

17、芯片技術(shù),它是將幾組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù),它是將幾十個或幾百個不同個體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順十個或幾百個不同個體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究,是一種高通量、多樣序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究,是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時對幾百本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時對幾百甚至上千種正?;蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病甚至上千種正?;蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本,進(jìn)行某一個或多個特定的基理生理狀態(tài)下的組織樣本,進(jìn)行某一個或多個特定的基因,或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。因,或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的

18、研究。病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)應(yīng)用應(yīng)用l免疫組化免疫組化lDNADNA或或RNARNA原位雜交原位雜交lFISHFISHl原位原位PCRPCR低密度芯片低密度芯片(50-70(50-70個標(biāo)本個標(biāo)本) )、高密度芯片、高密度芯片(500(500個標(biāo)本個標(biāo)本) )病理學(xué)常用研究方法(研究生課程)制作過程制作過程1. 1. 組織處理:固定、石蠟包埋、組織處理:固定、石蠟包埋、HEHE染色、組織定位染色、組織定位2. 2. 組織打孔組織打孔/ /陣列儀鉆取組織,直徑陣列儀鉆取組織,直徑0.6mm0.6mm3. 3. 制作陣列蠟塊,將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入制作陣列蠟塊,將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入空白蠟塊內(nèi)空白蠟塊內(nèi)4. 4. 切片厚度為切片厚度為

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