實(shí)驗(yàn)五、維生素C的定量測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五維生素維生素C C的定量測(cè)定的定量測(cè)定（2 2，6-6-二氯酚靛酚法）二氯酚靛酚法）一、目的與任務(wù)一、目的與任務(wù)u學(xué)習(xí)維生素學(xué)習(xí)維生素C 2C 2，6-6-二氯酚靛酚定量測(cè)定法的原理二氯酚靛酚定量測(cè)定法的原理和方法。和方法。u進(jìn)一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技術(shù)。進(jìn)一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技術(shù)。u掌握果蔬類樣品的處理及數(shù)據(jù)分析掌握果蔬類樣品的處理及數(shù)據(jù)分析u了解蔬菜、水果中維生素了解蔬菜、水果中維生素C C含量情況。含量情況。 維生素維生素C C是人類營(yíng)養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時(shí)會(huì)是人類營(yíng)養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時(shí)會(huì)產(chǎn)生壞血病，又稱抗壞血酸。對(duì)物質(zhì)代謝的調(diào)

2、節(jié)具有重要的產(chǎn)生壞血病，又稱抗壞血酸。對(duì)物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。作用。 維生素維生素C C是具有是具有L L系系糖型的不飽和多羥基物糖型的不飽和多羥基物，屬于，屬于水溶性水溶性維生素維生素。 分布很廣，植物的綠色部分及許多水果（如橘子、蘋果分布很廣，植物的綠色部分及許多水果（如橘子、蘋果、草莓、山楂等）、蔬菜（黃瓜、洋白菜、西紅柿等）中的、草莓、山楂等）、蔬菜（黃瓜、洋白菜、西紅柿等）中的含量豐富。含量豐富。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理維生素維生素C脫氫維生素脫氫維生素C維生素維生素 的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)C可以解離出兩個(gè)可以解離出兩個(gè)H+烯二醇結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)還原性烯二醇結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)還原性脫氫形式不穩(wěn)定易

3、降解脫氫形式不穩(wěn)定易降解二酮古樂(lè)糖酸二酮古樂(lè)糖酸+H2O-H2O（還原型）（還原型）（氧化型）（氧化型）有活性有活性還原型與氧化型可相互轉(zhuǎn)化還原型與氧化型可相互轉(zhuǎn)化O 草酸草酸+ +蘇阿糖酸蘇阿糖酸易溶于水，溶于乙醇，不溶于乙醚、苯。易溶于水，溶于乙醇，不溶于乙醚、苯。酸性溶液酸性溶液(pH4)較穩(wěn)定，中性以上極不穩(wěn)定。較穩(wěn)定，中性以上極不穩(wěn)定。對(duì)光、熱、金屬離子（鐵、銅）敏感對(duì)光、熱、金屬離子（鐵、銅）敏感。容易被氧化容易被氧化。維生素維生素C的特性的特性抗壞血酸分子中存在抗壞血酸分子中存在烯醇式結(jié)構(gòu)烯醇式結(jié)構(gòu) 因而具有很強(qiáng)的因而具有很強(qiáng)的還原性還原性，氧化失去兩個(gè)氫原子，氧化失去兩個(gè)氫原子

4、而轉(zhuǎn)變成脫氫抗壞血酸。而轉(zhuǎn)變成脫氫抗壞血酸。結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)2,6-2,6-二氯酚靛酚鈉鹽特點(diǎn)二氯酚靛酚鈉鹽特點(diǎn) 在酸性環(huán)境中氧化型在酸性環(huán)境中氧化型2 2，6-6-二氯酚靛酚呈二氯酚靛酚呈紅色紅色，在中性或，在中性或堿性溶液中呈堿性溶液中呈藍(lán)色藍(lán)色。 2,6- 2,6-二氯酚靛酚鈉鹽（二氯酚靛酚鈉鹽（C C1212H H6 6O O2 2NCNCl2l2Na)Na)染料具有染料具有氧化性氧化性，可，可氧化抗壞血酸而其本身被還原為氧化抗壞血酸而其本身被還原為無(wú)色無(wú)色的衍生物，可作為維生素的衍生物，可作為維生素C C含量測(cè)定的含量測(cè)定的滴定劑和指示劑滴定劑和指示劑。 本實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)在酸性條件下酸性條件下

5、進(jìn)行，此條件下副反應(yīng)進(jìn)行得很慢。進(jìn)行，此條件下副反應(yīng)進(jìn)行得很慢。 用用2 2，6-6-二氯酚靛酚滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時(shí)，在二氯酚靛酚滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時(shí)，在抗血酸尚未完全被氧化時(shí)，滴下的抗血酸尚未完全被氧化時(shí)，滴下的2 2，6-6-二氯酚靛酚立即被二氯酚靛酚立即被還原為還原為無(wú)色無(wú)色，當(dāng)抗壞血酸全被氧化時(shí)，滴下的，當(dāng)抗壞血酸全被氧化時(shí)，滴下的2 2，6-6-二氯酚二氯酚靛酚溶液呈靛酚溶液呈紅色紅色。所以在滴定過(guò)程中當(dāng)溶液從。所以在滴定過(guò)程中當(dāng)溶液從無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)槲o(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒓t色時(shí)紅色時(shí)，表示抗壞血酸全部被氧化，為滴定的終點(diǎn)。，表示抗壞血酸全部被氧化，為滴定的終點(diǎn)。 根據(jù)滴定消耗染料

6、標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，可以計(jì)算出被測(cè)定根據(jù)滴定消耗染料標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，可以計(jì)算出被測(cè)定樣品中抗壞血酸（維生素樣品中抗壞血酸（維生素C C）的含量。）的含量。三、材料、試劑、器材準(zhǔn)備三、材料、試劑、器材準(zhǔn)備試劑配制：試劑配制：材料：材料：蘋果、梨、青椒、蘋果、梨、青椒、VCVC飲料等飲料等l 1 1、2 2草酸溶液草酸溶液l 2 2，6-6-二氯酚靛酚溶液：二氯酚靛酚溶液： 稱取稱取0.21 g0.21 g碳酸氫鈉，碳酸氫鈉，0.26g 0.26g 2,6-2,6-二氯酚靛酚，溶于二氯酚靛酚，溶于250ml250ml蒸餾水中，稀釋到蒸餾水中，稀釋到1000ml. 1000ml. 過(guò)濾，裝入棕色瓶?jī)?nèi)，置

7、冰箱內(nèi)備用，保存不超過(guò)過(guò)濾，裝入棕色瓶?jī)?nèi)，置冰箱內(nèi)備用，保存不超過(guò)3 3天。天。每次臨用前用新配制的標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液標(biāo)定。每次臨用前用新配制的標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液標(biāo)定。l 標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液：標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液：準(zhǔn)確稱取純抗壞血酸結(jié)晶準(zhǔn)確稱取純抗壞血酸結(jié)晶100mg100mg溶于溶于1 1草酸溶液定容到草酸溶液定容到100ml100ml。裝入棕色瓶中貯存冰箱內(nèi)。裝入棕色瓶中貯存冰箱內(nèi)。器材準(zhǔn)備：微量滴定管（微量滴定管（5ml5ml）、勻漿器、離心機(jī)等）、勻漿器、離心機(jī)等微量滴定管的操作：微量滴定管的操作：l 檢查：檢查：用蒸餾水檢查滴定管的活塞是否漏水，活塞轉(zhuǎn)動(dòng)是否用蒸餾水檢查滴定管的活塞是否漏水，活

8、塞轉(zhuǎn)動(dòng)是否靈活。靈活。l 裝滴定劑裝滴定劑：搖勻試劑溶液，用試劑潤(rùn)洗滴定管：搖勻試劑溶液，用試劑潤(rùn)洗滴定管2-32-3次，約裝次，約裝10-15ml10-15ml左右。左右。l 排氣泡排氣泡：調(diào)節(jié)起始刻度（最好在整：調(diào)節(jié)起始刻度（最好在整mLmL的刻度處，或調(diào)零，并的刻度處，或調(diào)零，并記錄初始刻度數(shù)。記錄初始刻度數(shù)。l 滴定：滴定：勿頂活塞，防漏液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)活塞，滴定時(shí)邊用手腕勿頂活塞，防漏液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)活塞，滴定時(shí)邊用手腕輕輕搖動(dòng)錐形瓶，近終點(diǎn)時(shí)要輕輕搖動(dòng)錐形瓶，近終點(diǎn)時(shí)要“半滴半滴”操作操作沖洗。沖洗。l 觀察顏色的變化和讀數(shù)觀察顏色的變化和讀數(shù)。注意滴定管要垂直，視線與刻度平。注意滴定管要

9、垂直，視線與刻度平行，保留行，保留小數(shù)點(diǎn)后三位小數(shù)點(diǎn)后三位。l 滴定完畢，清洗干凈，涼干后在活塞處放一小紙片存放。滴定完畢，清洗干凈，涼干后在活塞處放一小紙片存放。四、操作方法四、操作方法樣品制備：樣品制備： 水洗干凈整株新鮮蔬菜或水果，用紗布或吸水水洗干凈整株新鮮蔬菜或水果，用紗布或吸水紙吸干表面水分。稱取紙吸干表面水分。稱取5g5g，加入，加入20ml 220ml 2草酸，勻草酸，勻漿，定容至漿，定容至50mL50mL，8000rpm8000rpm10min10min離心，留上清。離心，留上清。為什么要用為什么要用2%2%草酸溶液配制樣品？草酸溶液配制樣品？ 準(zhǔn)確量取準(zhǔn)確量取1ml1ml標(biāo)

10、準(zhǔn)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液加入溶液加入9ml 19ml 1草酸溶液于草酸溶液于100ml100ml錐形瓶。錐形瓶。 用用2 2，6-6-二氯酚靛酚溶液滴定，以生成為微紅色持續(xù)二氯酚靛酚溶液滴定，以生成為微紅色持續(xù)1515秒秒不退色為終點(diǎn)。不退色為終點(diǎn)。 計(jì)算計(jì)算2 2，6-6-二氯酚靛酚溶液的濃度，以每二氯酚靛酚溶液的濃度，以每ml2ml2，6-6-二氯酚二氯酚靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸的靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸的mgmg數(shù)來(lái)表示。數(shù)來(lái)表示。平行平行2 2次次 取取10ml 110ml 1草酸液做空白對(duì)照，按以上方法滴定。草酸液做空白對(duì)照，按以上方法滴定。標(biāo)定：標(biāo)定：為什么要做標(biāo)定？為什么要做標(biāo)定？

11、 量取量取10ml10ml樣品提取液于錐形瓶中。用微量滴定管，以樣品提取液于錐形瓶中。用微量滴定管，以2 2，6-6-二氯酚靛酚溶液滴定樣品提取液，呈微粉紅色色，持續(xù)二氯酚靛酚溶液滴定樣品提取液，呈微粉紅色色，持續(xù)1515秒鐘不退色為終點(diǎn)，記錄所用秒鐘不退色為終點(diǎn)，記錄所用2 2，6-6-二氯酚靛酚的二氯酚靛酚的mlml數(shù)。數(shù)。 另取另取10ml 210ml 2草酸做空白對(duì)照滴定。草酸做空白對(duì)照滴定。 樣品及空白同時(shí)各做樣品及空白同時(shí)各做2 2份。份。滴定：滴定：l 整個(gè)操作過(guò)程要迅速，防止還原型抗壞血酸被其他還原劑整個(gè)操作過(guò)程要迅速，防止還原型抗壞血酸被其他還原劑氧化。每次滴定過(guò)程一般不超過(guò)

12、氧化。每次滴定過(guò)程一般不超過(guò)2min2min。l 滴定所用的染料應(yīng)在滴定所用的染料應(yīng)在1-4ml1-4ml間。樣品含間。樣品含VCVC太高或太低時(shí)，可太高或太低時(shí)，可酌情增減樣液用量或改變提取液稀釋度酌情增減樣液用量或改變提取液稀釋度。l 每個(gè)小組需測(cè)出每個(gè)小組需測(cè)出8 8個(gè)數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)據(jù)，完成后數(shù)據(jù)教老師檢查：標(biāo)定、，完成后數(shù)據(jù)教老師檢查：標(biāo)定、樣品測(cè)定、樣品測(cè)定、1%1%草酸對(duì)照、草酸對(duì)照、2%2%草酸對(duì)照各草酸對(duì)照各2 2次。次。特別注意特別注意 干擾滴定因素有：干擾滴定因素有：p色素色素：若提取液中色素很多時(shí)，滴定不易看出顏色變化：若提取液中色素很多時(shí)，滴定不易看出顏色變化，可用白陶土脫色

13、。，可用白陶土脫色。p還原劑還原劑：樣品中可能有其它雜質(zhì)還原二氯酚靛酚，但反：樣品中可能有其它雜質(zhì)還原二氯酚靛酚，但反應(yīng)速度均較抗壞血酸慢，因而滴定開(kāi)始時(shí)，染料要迅速應(yīng)速度均較抗壞血酸慢，因而滴定開(kāi)始時(shí)，染料要迅速加入，而后盡可能一點(diǎn)一點(diǎn)地加入，并要不斷地?fù)u動(dòng)三加入，而后盡可能一點(diǎn)一點(diǎn)地加入，并要不斷地?fù)u動(dòng)三角瓶直至呈粉紅色，于角瓶直至呈粉紅色，于15s15s內(nèi)不消退為終點(diǎn)。內(nèi)不消退為終點(diǎn)。 某些水果、蔬菜（如橘子、西紅柿等）漿狀物泡沫太多，某些水果、蔬菜（如橘子、西紅柿等）漿狀物泡沫太多，可加數(shù)滴丁醇或辛醇?？杉訑?shù)滴丁醇或辛醇。注意各管滴定終點(diǎn)均為微紅色注意各管滴定終點(diǎn)均為微紅色五、結(jié)果計(jì)算

14、五、結(jié)果計(jì)算 l 維生素維生素C C含量（含量（mg/100gmg/100g樣品樣品）= = l V VA A為滴定樣品提取液所用的為滴定樣品提取液所用的 2 2, ,6-6-二氯酚靛酚溶液的二氯酚靛酚溶液的mLmL數(shù)數(shù)l V VB B為滴定空白對(duì)照所用的為滴定空白對(duì)照所用的 2 2, ,6-6-二氯酚靛酚溶液的二氯酚靛酚溶液的mLmL數(shù)數(shù)l S S為為1mL1mL染料能氧化抗壞血酸染料能氧化抗壞血酸mgmg數(shù)數(shù)( (需根據(jù)標(biāo)定值計(jì)算）需根據(jù)標(biāo)定值計(jì)算）l W W為待測(cè)樣品的重量。為待測(cè)樣品的重量。注意測(cè)定時(shí)樣品有稀釋的要乘上稀釋倍數(shù)注意測(cè)定時(shí)樣品有稀釋的要乘上稀釋倍數(shù)100WS)VV(BA六、課后研討六、課后研討l 重點(diǎn)：重點(diǎn)：結(jié)果記錄和計(jì)算結(jié)果記錄和計(jì)算l 總結(jié)本實(shí)驗(yàn)的操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)。總結(jié)本實(shí)驗(yàn)的操