活體細(xì)胞溶酶體膜通透性LMP完整性吖啶橙熒光檢測試

1、活體細(xì)胞溶酶體膜通透性(LMP ) /完整性吖啶橙熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)主要用途活體細(xì)胞溶酶體膜通透性(LMP) /完整性吖啶橙熒光檢測試劑是一種旨在通過吖啶橙吸收和細(xì)胞內(nèi)再分布檢測技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，即存在于或由溶酶體釋放到細(xì)胞漿的熒光染料的不同熒光強(qiáng)度變化，來分析和觀察溶酶體膜通透性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞溶酶體(動物、人體、昆蟲等)膜通透性的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到 即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景溶酶體(lysosome)是一種動態(tài)性的、多態(tài)性的、含有水解酶的細(xì)胞器，具有接受

2、和降解來自于分泌性、 內(nèi)吞性(endocytic)、自噬性(autophagic)、吞噬性(phagocytic)膜運(yùn)轉(zhuǎn)通路中的大分子。其功能是膜依 賴性，具有解毒和防御作用。溶酶體膜是溶酶體內(nèi)基質(zhì)和胞漿之間的生理屏障，為整合性糖蛋白，防止細(xì)胞自我降解。一旦溶酶體膜去穩(wěn)定(destabilization ) ，例如堿性化或內(nèi)容物移位(translocation ) ，將導(dǎo)致質(zhì)子和水解酶外漏，而造成細(xì)胞器功能異常，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞壞死、凋亡， 以及病理癥狀，例如朊病毒腦病( prionencephalopathies) 、阿茨罕默病、心肌缺血、脊髓灰質(zhì)炎病毒感染、補(bǔ)體激活型肺損傷(complemen

3、tactivation-produced lung injury ) 、急性組織損傷等疾病。其中膜通透性增加，是溶酶體膜去穩(wěn)定性或去完整性的標(biāo)志之一，溶酶體內(nèi)容物大量釋放到胞漿中，直接影響細(xì)胞的存活。吖啶橙(acridine orange； AO )是一種親溶酶體( lysomotropic ) 異染性 ( metachromatic ) 的熒光染料，在完整的溶酶體內(nèi)，為質(zhì)子化 ( protonated)寡聚體(oligomeric)形式，呈現(xiàn)紅色熒光(激發(fā)波長555nm,散發(fā)波長617nm),而在胞漿內(nèi)，為單體去質(zhì)子化形式，呈現(xiàn)綠色熒光(激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長528nm)。口丫咤橙進(jìn)入

4、溶酶體后重新分布，即吸收和細(xì)胞內(nèi)再分布(uptakeand redistribution ) ，用于分析溶酶體膜通透性狀況。產(chǎn)品內(nèi)容清理液(Reagent A)毫升染色液(Reagent B)微升產(chǎn)品說明書1 份保存方式保存 染色液(Reagent B)在20C冰箱里，避免光照；其余的保存在4c冰箱里；有效保證 6月用戶自備24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器1.5 毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器微型臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育(共聚焦)熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析 細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析實(shí)驗(yàn)步驟貼壁細(xì)胞染色1 .準(zhǔn)備

5、1個細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測細(xì)胞(注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項(xiàng)8)2 .小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液3 .小心沿著孔壁加入xx微升37c預(yù)熱的 清理( Reagent A)到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面4 .小心抽去清理液5 .小心沿著孔壁加入xx微升染色液(Reagent B)到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面6 .放進(jìn)37 c細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育 15分鐘，避免光照7 . 小心抽去染色液(Reagent B)8 .小心沿著孔壁加入xx微升37c預(yù)熱的 清理( Reagent A)到細(xì)胞培養(yǎng)孔9 .小心抽去清理液10 .重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8和9 一次11 .小心沿

6、著孔壁加入xx微升37c預(yù)熱的 清理( Reagent A)到細(xì)胞培養(yǎng)孔12 .選擇下列方式之一進(jìn)行操作：(A)使用倒置熒光顯微鏡觀察(定性檢測) ：激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長528nm-綠色熒光增強(qiáng)，表明膜通透性(LMP )增強(qiáng)激發(fā)波長555nm,散發(fā)波長617nm紅色熒光減弱，表明膜通透性(LMP)增強(qiáng)(B)激發(fā)波長使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(定量檢測)：490nm,散發(fā)波長528nm- RFU升高，表明膜通透性(LMP )增強(qiáng)激發(fā)波長555nm,散發(fā)波長617nmRFU降低，表明膜通透性(LMP )增強(qiáng)懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色1 ,將懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞(1 X 10 6細(xì)胞)移入

7、到1.5毫升離心管2 . 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心 5分鐘，速度為 300g (或2000RPM,例如eppendorf 5415)3 .小心抽去上清液4 .加入xx微升37c預(yù)熱的 清理?R ( Reagent A),混勻細(xì)胞顆粒群5 . 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心 5分鐘，速度為 300g (或2000RPM,例如eppendorf 5415)6 .小心抽去上清液7 .加入xx微升37c預(yù)熱的 清理?R ( Reagent A),混勻細(xì)胞顆粒群8,加入xx微升含有 染色液(Reagent B),充分混勻 9.放進(jìn)37c細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育 15分鐘，避免光照10 .放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心 5分鐘，速

8、度為 300g (或2000RPM,例如eppendorf 5415)11 .小心抽去上清液12 .加入xx微升37c預(yù)熱的 清理( Reagent A),混勻細(xì)胞顆粒群13 .放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心 5分鐘，速度為 300g (或2000RPM,例如eppendorf 5415)14 .小心抽去上清液15 .重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12至14 一次16 .加入xx微升37c預(yù)熱的 清理?R （ Reagent A）,混勻細(xì)胞顆粒群17 .選擇下列方式之一進(jìn)行操作：a） 進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：FL1 （激發(fā)波長488nm,散發(fā)波長528nm）,或FL3 （激發(fā)波長555nm, 散發(fā)波長617nm）觀察100

9、00個細(xì)胞以上一一FL1 :波峰右移，表明膜通透性（ LMP）增強(qiáng)FL3:波峰左移，表明膜通透性（ LMP）增強(qiáng)b） 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長528nm-綠色熒光增強(qiáng)，表明膜通透性（LMP ）增強(qiáng)激發(fā)波長555nm,散發(fā)波長617nm- 紅色熒光減弱，表明膜通透性（ LMP ）增強(qiáng)c） 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯2）加入xx微升清理?R （ Reagent A）3）上下傾倒混勻數(shù)次4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長528nmRFU升高，表明月M通透性（LMP ）增強(qiáng)激發(fā)波長555nm,散發(fā)波長617nmRFU降低，表明膜通透性（LMP ）增強(qiáng)注意事項(xiàng)1 .本產(chǎn)品為20次（0.5毫升體系/次）操作2 .操作時，須戴手套3 .操作時，避免污染母液4 .建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析5 .孵育時，必須避免光照6 .本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：操作容器建議操作體系載玻片100微升載玻片培養(yǎng)皿1毫升35mm培養(yǎng)皿1毫升96孔培養(yǎng)板100微升48孔培養(yǎng)板200微升24孔培養(yǎng)板500微升12孔培養(yǎng)板1毫升6孔培養(yǎng)板2毫升25cm2細(xì)胞培養(yǎng)